1. 复古眶出血

图1。小鼠眶内退血。
2. 尾部出血程序: 尾剪和尾尼克
3. 心血采集

图2。用小鼠垂直保持心脏血退。

图3。用小鼠在背卧床位置取出心脏血。
4. 后腔静脉血退

图4。从后腔静脉取出血。
来源: 凯斯图尔特, RVT, RLATG, CMAR;瓦莱丽. 施罗德, RVT, RLATG。圣母大学
血液收集是一个共同的要求, 研究研究, 涉及老鼠和老鼠。小鼠和大鼠的血液提取方法取决于所需的血液体积、取样的频率、被放血的动物的健康状况以及技术员的技术水平。1所讨论的所有方法--向后眶窦出血、初始尾剪出血和心内出血--需要使用全身麻醉。
1. 复古眶出血

图1。小鼠眶内退血。
2. 尾部出血程序: 尾剪和尾尼克
3. 心血采集

图2。用小鼠垂直保持心脏血退。

图3。用小鼠在背卧床位置取出心脏血。
4. 后腔静脉血退

图4。从后腔静脉取出血。
采血是涉及小鼠和大鼠的几项研究的常见要求。这些动物抽血方法的选择取决于许多因素,例如所需的血液量、采样频率、要放血的动物的健康状况以及技术人员的技能水平。
在这里,我们将回顾这些注意事项并概述采血程序,包括眶后眼出血、剪尾和划痕,以及心内采血。有关其他方法,请参阅本系列中的第二个视频。
在深入研究采血方案之前,让我们首先回顾一些一般考虑因素,包括样本类型、针头选择和可以采集的最大血容量。在采集小鼠或大鼠的血液之前,必须确定所需的血样类型。实验程序可能需要全血、血浆或血清。
如果采集全血,必须在样本中添加抗凝剂以防止凝血。常用的抗凝剂包括肝素、柠檬酸钠和乙二胺四乙酸,缩写为 EDTA。抗凝剂可以直接装入注射器中以涂覆表面。这允许在抽取血液时直接接触抗凝剂,有助于防止凝血。由于啮齿动物的血液凝结迅速,因此必须使用正确的抗凝剂与血液比例。血浆采集需要用抗凝剂离心全血。旋转后,WBC 和血小板层上方的半透明液体是血浆。它含有纤维蛋白原和其他凝血因子。另一方面,血清是从全血样本中采集的,不含抗凝剂。而且由于样品已经凝结,因此血清(最主要的血清)不含纤维蛋白原或其他凝血因子。
针头的选择基于动物的大小和静脉穿刺的部位。一般来说,大口径针头对血细胞造成的损伤较小,并且能够更快速地采集血液;但更有可能造成血管损伤。还应考虑针头长度。如果针头太长,使用起来可能会很尴尬,或者血液可能在针头内时开始凝结。尺寸选择范围从 18 到 29 号和 0.5 到 1.5 英寸长。每种方法的合适针头尺寸将在程序部分讨论。
最后,由于啮齿类动物体型小,单次抽血可以采集的血液量是最大的,不会对生物体造成严重伤害。抽血可以不补液或补液 - 通常使用 0.9% 生理盐水进行。每种情况下的上限在下面的文本协议中列出。此外,一些实验需要多次样本采集,在这种情况下,除了液体替代外,动物也需要时间来补充血细胞。同样,在连续采集期间可以收集的最大数量,上限在下面的协议中列出。
在回顾了一些一般注意事项之后,让我们进入具体的抽血技术,从眼眶后出血开始 - 科学家用来从眼睛附近的血管中收集少量血液的技术。请注意,小鼠和大鼠的眼眶区域的解剖结构不同。大鼠有一条在眼睛后面流动的血管丛,而老鼠有一组血管,这些血管会形成一个后眶窦,这使得在小鼠中更容易执行该程序。
首先拿一根管子进行采血。首选可容纳 50-75 μL 的微量血细胞比容管。在工作台面上放上几张纸巾或其他绝缘材料。这是为了在手术过程中保持动物的体温。现在使用吸入麻醉剂(如异氟醚)麻醉动物。动物完全麻醉后,将其从腔室中取出,并将其放在处于侧卧位的一侧。接下来,将手指放在头顶和下巴线,然后向后和向下拉动皮肤以引起眼睛突出。避免对气管施加压力,因为这可能会导致窒息死亡。随后,将微红细胞比容管放置在眼睛的内眦中,并以 30 至 45 度角将其与鼻子平面成 30 至 45 度角指向尾部。在轻轻旋转管子的同时施加压力。这将切穿结膜并破坏眼丛或鼻窦。血液将通过毛细血管作用流入血细胞比容管。避免将管子推得太深,以免撞到眼腔后部的骨头。一旦血液开始流动,保持压力以保持眼睛突出。要止血,请松开皮肤,让眼睛恢复到正常位置。施加压力以促进止血。对于重复样品采集,两次放血之间至少间隔 10 天。这为组织提供了一些愈合时间。
虽然眼眶后出血是一种常见的手术,但人们对其人道性存在许多担忧。这些包括由于血细胞比容管过度运动而导致的肿胀。这反过来会导致眼球突出并阻碍眼睑闭合,从而导致角膜干燥、损伤和疼痛,从而引发抓挠和自残。血细胞比容管放置不当会切断视神经,导致失明。另一种可能的并发症是眼睛可能被迫离开眼眶,使眼睑落在眼球后面。此外,脆弱的眼眶骨破裂、穿透眼球导致玻璃体液丧失或眼后血肿的形成可能导致极度疼痛,都可能引起问题。尽管存在所有这些担忧,但如果由熟练的技术人员执行该程序并且动物被完全麻醉,则眼眶后出血是啮齿动物采血的有效方法。
现在让我们回顾一下尾部出血的注意事项和程序,它允许收集小体积的系列样本。此过程所需的设备包括一把无菌的 11 号手术刀。不应使用剪刀,因为剪刀造成的伤口会压碎,这会促进凝血并减少血液流动。其他工具是允许进入动物尾巴的约束管;吸水纸巾;收集或血细胞比容管和止血粉 - 以帮助止血。
首先将动物固定在约束管中。然后,用温水擦拭尾巴以去除碎屑并引起轻微的血管舒张。不要使用热水。伸出尾巴,用手术刀刀片剪断尾巴的最末端,以使用血细胞比容或收集管收集血液。可以从臀部到尖端抚摸或"挤奶"尾巴,以促进血液流动。但是,这会降低样品的质量。
要止血,请用纱布垫对尾尖施加压力。止血粉可用于止血。每 5 到 10 分钟检查一次动物,以确保已实现止血,重复采样后可能会延迟。从剪尾器采集的样本可能含有动脉血和静脉血,以及组织产品污染。然而,这种采血程序允许通过破坏尾巴末端原始切口的结痂或凝块来进行连续采集。
剪尾的另一种采血方法是尾血管切口,它的侵入性相对较小。为此,使用相同的手术刀刀片,直接在侧尾静脉上做一个小切口,大约是距臀部距离的三分之二。与剪尾一样,血液可以收集在采集管或血细胞比容管中。必须通过对该部位施加压力并每 5-10 分钟重新检查动物来确保止血。然而,与剪尾一样,样品可能被组织产品污染。
通常需要非存活大血样的研究,这是通过心内出血或尾腔静脉放血完成的。
对于小鼠的心内方法,您需要一个带有 3 -22 号 1 英寸针头的 25 cc 注射器。对于大鼠,首选带有 10 号 12 号针头的 18-1.5 cc 注射器。请参阅下面的协议,了解为什么这些需求和注射器是理想的。
首先使用二氧化碳对动物实施安乐死。安乐死后,握住啮齿动物的骷髅,身体垂直悬挂。这种约束很关键,因为身体应该挺直,以防止心脏偏转或胸部扭曲。请注意,心脏大约位于肘部水平。插入侧位于剑突左侧的切槽中,平行于脊柱和肋骨下方。
将针头向上斜切插入胸部并刺穿心脏。用注射器施加轻微的背压。如果针头在心脏中,血液会流入注射器。等到血液充满枪管后,再添加额外的背压。通过心脏穿刺可以从小鼠或大鼠收集大约一半的总血容量。这相当于一只普通小鼠的大约 1 mL 血液和一只普通大鼠的大约 10 mL 血液
使用外侧入路时,另一种姿势是背侧卧位。在这种情况下,将针头放在动物左侧的肋骨之间。入口点是针对肘部在胸壁上的点测量的。将针头向上倾斜,垂直于桌子平面插入胸壁中间的一点。用注射器施加轻微的背压。如果针头在心脏中,血液将流入注射器。同样,等到血液充满枪管后,再添加额外的背压。请注意,无论哪种位置,过大的背压都可能使心脏塌陷,从而阻塞针头斜面并阻止血液流入注射器。
另一种采集心脏血液的方法是通过腔尾静脉。此过程所需的设备是带有正确尺寸针头的合适注射器;用于打开腹腔的剪刀、小型无创伤拇指镊子和纱布海绵。该技术要求在整个手术过程中对动物进行深度麻醉并保持麻醉。CO2 麻醉不是一种选择,因为动物心脏必须跳动才能进行此手术。将动物置于背卧位,并将四肢固定在平台上。四肢应从身体向外伸展。
现在用镊子提起皮肤,然后用剪刀在女性骨盆或男性包皮上方的皮肤上做一个小的横向切口。接下来,将剪刀的尖端放入切口中,从骨盆或包皮到剑突穿过皮肤做一个中线切口。在皮肤横向反射的情况下,抬起肌肉并在皮肤切口上方的肌肉上做一个小的横向切口。
将剪刀的尖端放入腹部,然后通过肌肉做一个中线切口到剑突。确保剪刀尖向上倾斜,以防止割伤任何器官。沿每侧肋骨的曲线横向切割。小心不要刺穿肝脏。轻轻地将肠道移动到动物的左侧,露出后腔静脉。将纱布垫放在肝脏上,然后将食指和中指放在上面。用另一只手插入针头,斜向腔静脉,位于肾血管交界处和髂分叉处之间。慢慢抽出血液,同时对肝脏施加压力。
避免手部移动,因为这可能会导致血管破裂。此外,过快的血液抽吸会导致血管塌陷到斜面上,堵塞开口并阻止血液收集。这种技术的主要优点是能够收集无菌样本,因为针头不会穿过皮肤。
最后,让我们看看这些抽血技术的一些应用。免疫肿瘤学是一个新兴领域,该领域的研究人员经常进行采血以研究癌症发展不同阶段的免疫细胞。例如,研究人员从荷癌小鼠身上收集心脏血液,以分离和量化肿瘤植入后第 10 天、第 20 天和第 30 天的中性粒细胞。
另一方面,生理学家也经常研究血液成分。与这项研究一样,研究人员对评估糖尿病动物的肾功能感兴趣。为了做到这一点,这些科学家首先将一种染料注射到糖尿病动物模型中。接下来,他们使用尾剪法在几个时间点采集血液,以评估血液中的染料浓度,最终用于计算肾小球滤过率,突出糖尿病诱导后肾功能的差异。
最后,干细胞研究人员使用血液样本来评估供体细胞成功整合到受体系统中的情况。在这里,研究人员首先通过尾静脉注射将雄性小鼠的骨髓细胞移植到野生型和转基因雌性动物中。接下来,他们从受体小鼠的眶后窦收集血液,以使用聚合酶链反应研究血细胞的基因组 DNA。这提供了两种动物中供体细胞植入的百分比。
您刚刚观看了 JoVE 关于抽血技术的第一部分。请观看该系列的下一个视频,回顾如何在实验动物中执行其他常用的血液采集技术。一如既往,感谢您的观看!
在出血过程之前, 必须确定所需样品的类型。实验程序可能需要全血、血浆或血清。对于全血, 必须在样品中加入抗凝剂。血浆, 其中含有纤维蛋白原和其他凝血因子, 当与红细胞分离, 可以从一个抗凝样本提取。血清是通过血液采集而获得的, 没有抗凝血。一旦血块形成, 血清就会从样品的离心中产生。由于样品已凝结, 血清不会含有纤维蛋白原或其他凝血因子。血浆和血清都是通过使用离心机运行在 2200-2500 RPM 至少15分钟。
对于必须产生全血或血浆的样品, 必须使用适当的抗凝剂。实验室动物常用的抗凝剂是肝素、柠檬酸钠和乙二胺乙酸酸 (EDTA);选择的依据是研究的需要。封存--EDTA、肝素和枸橼酸钠的液体形式--可以直接装入注射器以涂上表面。这就可以直接接触抗凝血的血液被绘制, 协助预防凝血。由于鼠血凝块比大多数哺乳动物的血液凝结得快, 因此必须将抗凝血的正确比例用于血液采集。
针的选择依据的是动物的大小和穿刺部位。一般而言, 针头的孔径越大, 样品收集起来就越迅速。对更大的针头来说, 减少对血液细胞的伤害是另一个好处。然而, 大口径针头的主要缺点是对容器的潜在损害。对小鼠和大鼠, 大小的选择范围从20-29 口径针, 是 0.5-1.5 英寸的长度。如果针头太长, 不仅使用起来很笨拙, 而且在针头上有多余的空间会导致凝固。"过程" 部分中的每个方法都列出了适当的针大小。
所需样本的大小也必须预先确定。由于小老鼠或老鼠的大小, 血液收集的最大数量必须计算为生存出血。每只体重25克的小鼠总血容量为1.8 毫升;平均体重250克的鼠总血容量为16毫升。对于没有液体置换的小鼠或大鼠的单个血液样本, 可以安全去除的最大血容量是总血量的 10%, 或 7.7-8 µl/克。 因而为一个平均老鼠, 10% 它的血液容量是193-200 µl。对于250克的平均鼠来说, 这相当于 1.9-2.0 毫升. 研究表明, 去除超过15% 的血容量会引起休克休克。12然而, 随着体液置换, 多达15% 的总血容量-或12µl/克-可以删除。对于25克鼠标, 这相当于300µl;对于一个250克大鼠, 它相当于3毫升。对于流体置换, 液体应加热, 并给予皮下注射。
如果有必要采取多样本, 血液体积绘制减少。每周可抽取的最大血量不超过总血量的 7.5%, 或6µl/克。 对于一个25克鼠标, 这相当于每星期145-150 µl。对于一个250克大鼠, 这相当于 1.45-1. 50 毫升每星期。 如果取样将每2周发生一次, 则可抽取10% 的总血容量 (8 µl/克)。这相当于200µl 每2周的平均鼠标, 和2.00 毫升每2周为250克鼠。一项对平均重量为250克的大鼠进行的一项研究显示, 当血液的15-20% 被移除时, 血液水平的正常化需要超过29天的时间。12对于重复的血液收集, 液体替换不允许更大的血液容量或更频繁的血液汇集, 因为它只替换容量。这只动物需要时间补充血液细胞。
使用回溯式眶丛是过去常见的做法。然而, 对这一程序的仁爱的许多关注已经出现。在手术过程中, 红细胞压积管的过度运动一旦放置在眼睛的内侧眼角, 就会对周围组织造成损伤, 导致眼睑和/或结膜膜肿胀。肿胀的组织可导致眼球凸出足够远, 使眼睑闭合受阻, 可能导致角膜干燥和损伤。肿胀的疼痛会引起抓挠和自残, 导致眼球摘除。不正确放置红细胞压积管在一个复古眶出血可以切断视神经, 导致失明。如果红细胞压积管是在一个不适当的角度推进, 眼睛可以被迫离开轨道, 让眼睑落在眼球后面。如果出现这种情况, 则很难将眼睛正确地替换到插槽中。其他可能出现的问题包括: 对脆弱的轨道骨骼的破裂, 眼球球体的穿透, 导致玻璃体液的丧失, 或者眼睛后面的血肿形成, 由于眼睛和周围的压力, 会导致极度疼痛。结构.尽管所有这些问题, 如果一个熟练的技术员执行的程序和动物完全麻醉与一般麻醉, 如异氟醚吸入麻醉, 复古眼眶出血已证明是一种有效的方法的血液收集啮齿目动物。
在小鼠和老鼠之间, 眶区的解剖结构是不同的。老鼠有一个复古的眼窝窦-一个收集的血管, 创造了一个鼻窦在轨道区域。在鼠眼的眼眶里, 有一丛血管在那眼后面流动;然而, 它们并不像老鼠那样形成一个窦。因此, 对小鼠进行这一过程比较容易。对于重复采样收集通过回溯轨道丛, 至少10天之间的出血是需要的, 使该地区的组织愈合。虽然一般麻醉建议, 该程序可以执行的小鼠没有全身麻醉, 如果一个局部眼科麻醉, 如丙或丁卡因, 是在程序之前应用。由于大鼠没有逆行眶窦, 而且由于其周围的薄膜的轨道更强, 因此必须麻醉它们。
使用尾夹法可以获得小体积的串口样品。尾巴的最初截肢必须限制在尾巴尖端, 大约 0.5-1.0 毫米长的小鼠和2.0 毫米的大鼠。1通过将原始切口的痂或血块阻断到尾部的尾部, 可以进行血液采集的尾剪程序。一般情况下, 附加的尾端截肢是不必要的。收集的血量范围从20-100 µL 的小鼠和75-150 µL 的大鼠。收集到的数量在动物之间是可变的, 并且可以受年龄、健康状况和体重的影响。
从尾部切片收集的样本可以同时包含动脉和静脉血, 以及组织产品的污染。如果尾巴被抚摸或 "挤奶" 以获得更多的血液, 样品质量就会降低。为了增加血液流量, 可以用热敷、加热灯或在温水中浸泡尾部来加热。应将压力应用于尾部止血, 每5-10 分钟检查一次动物, 以确保止血效果。止血常因反复取样而延迟。止血粉可用于止血。对于最初的截肢, 建议麻醉 (一般或局部)。随后的出血不应要求麻醉, 特别是当动物习惯于程序。麻醉会导致血压下降, 使血液收集与此技术困难。
尾巴剪的另一种选择是尾巴船尼克。这一过程很容易在老鼠和小鼠身上进行。然而, 与尾巴剪, 样品可能被污染与组织产品, 特别是在老鼠。对于大鼠, 皮下注射针头插入血管, 血液从针的中心收集。一项研究显示, 在穿刺部位上方放置止血带, 以帮助血液收集。3注射器不用于抽取血管中的血液, 因为注射器产生的压力会使血管坍塌。这种方法也可以用于连续取样, 因为血块可以被移除, 从而导致站点再次出血。与尾部剪, 这是当务之急, 以确保止血的应用压力, 对现场和复核的动物每5-10 分钟。
通常, 研究需要一个 nonsurvival, 大的血液样本, 通过失血通过心腔出血或尾静脉静脉收集。4心脏穿刺可以从老鼠或大鼠身上采集到总血量的大约一半。这相当于40µl/克或大约1毫升的平均25克鼠标。250克老鼠会产生大约10毫升的血液。动物必须被麻醉为失血。吸入麻醉或 CO2麻醉可由熟练技师使用;注射麻醉也可以使用。然而, 血压和血液循环可能减少, 这可能会减少血液的采集量。
尾腔静脉法要求对动物进行深度麻醉, 以手术暴露血管。CO2麻醉是不够的, 因为心脏必须跳动和动物呼吸在血液撤退。在手术过程中, 抽血速度过快会导致血管塌陷, 咬合, 防止血液收集。此外, 船只的墙壁是薄的, 因此, 必须避免手和针的运动, 以防止从针进入现场的血液破裂或泄漏。由于针不是通过皮肤, 这种方法导致收集一个无菌样品。必须采用辅助安乐死的方法, 以确保动物不会从麻醉中恢复。这种方法通常是心脏或主动脉灌注后。
心腔方法可在被麻醉 (闭合方法) 的动物中进行人工约束, 或者根据骶管静脉采血方法 (open 方法) 的规定, 对心脏进行手术暴露。对于封闭的方法, 针放置的标志是在剑过程中的肋骨笼形成的凹槽, 在动物的左侧。
小鼠和老鼠的血液收集可以通过多种技术来完成。虽然许多因素, 如样本大小, 抽样频率, 以及动物的大小和年龄影响这一点, 最重要的组成部分是技能水平的技术员执行样本收集。 对于这里描述的方法, 正确使用麻醉剂对质量样品和动物的福祉也是至关重要的。
Chapters in this video
0:00
Overview
0:56
General Considerations for Blood Withdrawal
3:57
Retro Orbital Bleed
7:18
Tail Bleed
9:42
Cardiac Blood Collection
14:15
Applications
16:07
Summary
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