血液采集 I

采血是涉及小鼠和大鼠的几项研究的常见要求。这些动物抽血方法的选择取决于许多因素，例如所需的血液量、采样频率、要放血的动物的健康状况以及技术人员的技能水平。

在这里，我们将回顾这些注意事项并概述采血程序，包括眶后眼出血、剪尾和划痕，以及心内采血。有关其他方法，请参阅本系列中的第二个视频。

在深入研究采血方案之前，让我们首先回顾一些一般考虑因素，包括样本类型、针头选择和可以采集的最大血容量。在采集小鼠或大鼠的血液之前，必须确定所需的血样类型。实验程序可能需要全血、血浆或血清。

如果采集全血，必须在样本中添加抗凝剂以防止凝血。常用的抗凝剂包括肝素、柠檬酸钠和乙二胺四乙酸，缩写为 EDTA。抗凝剂可以直接装入注射器中以涂覆表面。这允许在抽取血液时直接接触抗凝剂，有助于防止凝血。由于啮齿动物的血液凝结迅速，因此必须使用正确的抗凝剂与血液比例。血浆采集需要用抗凝剂离心全血。旋转后，WBC 和血小板层上方的半透明液体是血浆。它含有纤维蛋白原和其他凝血因子。另一方面，血清是从全血样本中采集的，不含抗凝剂。而且由于样品已经凝结，因此血清（最主要的血清）不含纤维蛋白原或其他凝血因子。

针头的选择基于动物的大小和静脉穿刺的部位。一般来说，大口径针头对血细胞造成的损伤较小，并且能够更快速地采集血液;但更有可能造成血管损伤。还应考虑针头长度。如果针头太长，使用起来可能会很尴尬，或者血液可能在针头内时开始凝结。尺寸选择范围从 18 到 29 号和 0.5 到 1.5 英寸长。每种方法的合适针头尺寸将在程序部分讨论。

最后，由于啮齿类动物体型小，单次抽血可以采集的血液量是最大的，不会对生物体造成严重伤害。抽血可以不补液或补液 - 通常使用 0.9% 生理盐水进行。每种情况下的上限在下面的文本协议中列出。此外，一些实验需要多次样本采集，在这种情况下，除了液体替代外，动物也需要时间来补充血细胞。同样，在连续采集期间可以收集的最大数量，上限在下面的协议中列出。

在回顾了一些一般注意事项之后，让我们进入具体的抽血技术，从眼眶后出血开始 - 科学家用来从眼睛附近的血管中收集少量血液的技术。请注意，小鼠和大鼠的眼眶区域的解剖结构不同。大鼠有一条在眼睛后面流动的血管丛，而老鼠有一组血管，这些血管会形成一个后眶窦，这使得在小鼠中更容易执行该程序。

首先拿一根管子进行采血。首选可容纳 50-75 μL 的微量血细胞比容管。在工作台面上放上几张纸巾或其他绝缘材料。这是为了在手术过程中保持动物的体温。现在使用吸入麻醉剂（如异氟醚）麻醉动物。动物完全麻醉后，将其从腔室中取出，并将其放在处于侧卧位的一侧。接下来，将手指放在头顶和下巴线，然后向后和向下拉动皮肤以引起眼睛突出。避免对气管施加压力，因为这可能会导致窒息死亡。随后，将微红细胞比容管放置在眼睛的内眦中，并以 30 至 45 度角将其与鼻子平面成 30 至 45 度角指向尾部。在轻轻旋转管子的同时施加压力。这将切穿结膜并破坏眼丛或鼻窦。血液将通过毛细血管作用流入血细胞比容管。避免将管子推得太深，以免撞到眼腔后部的骨头。一旦血液开始流动，保持压力以保持眼睛突出。要止血，请松开皮肤，让眼睛恢复到正常位置。施加压力以促进止血。对于重复样品采集，两次放血之间至少间隔 10 天。这为组织提供了一些愈合时间。

虽然眼眶后出血是一种常见的手术，但人们对其人道性存在许多担忧。这些包括由于血细胞比容管过度运动而导致的肿胀。这反过来会导致眼球突出并阻碍眼睑闭合，从而导致角膜干燥、损伤和疼痛，从而引发抓挠和自残。血细胞比容管放置不当会切断视神经，导致失明。另一种可能的并发症是眼睛可能被迫离开眼眶，使眼睑落在眼球后面。此外，脆弱的眼眶骨破裂、穿透眼球导致玻璃体液丧失或眼后血肿的形成可能导致极度疼痛，都可能引起问题。尽管存在所有这些担忧，但如果由熟练的技术人员执行该程序并且动物被完全麻醉，则眼眶后出血是啮齿动物采血的有效方法。

现在让我们回顾一下尾部出血的注意事项和程序，它允许收集小体积的系列样本。此过程所需的设备包括一把无菌的 11 号手术刀。不应使用剪刀，因为剪刀造成的伤口会压碎，这会促进凝血并减少血液流动。其他工具是允许进入动物尾巴的约束管;吸水纸巾;收集或血细胞比容管和止血粉 - 以帮助止血。

首先将动物固定在约束管中。然后，用温水擦拭尾巴以去除碎屑并引起轻微的血管舒张。不要使用热水。伸出尾巴，用手术刀刀片剪断尾巴的最末端，以使用血细胞比容或收集管收集血液。可以从臀部到尖端抚摸或"挤奶"尾巴，以促进血液流动。但是，这会降低样品的质量。

要止血，请用纱布垫对尾尖施加压力。止血粉可用于止血。每 5 到 10 分钟检查一次动物，以确保已实现止血，重复采样后可能会延迟。从剪尾器采集的样本可能含有动脉血和静脉血，以及组织产品污染。然而，这种采血程序允许通过破坏尾巴末端原始切口的结痂或凝块来进行连续采集。

剪尾的另一种采血方法是尾血管切口，它的侵入性相对较小。为此，使用相同的手术刀刀片，直接在侧尾静脉上做一个小切口，大约是距臀部距离的三分之二。与剪尾一样，血液可以收集在采集管或血细胞比容管中。必须通过对该部位施加压力并每 5-10 分钟重新检查动物来确保止血。然而，与剪尾一样，样品可能被组织产品污染。

通常需要非存活大血样的研究，这是通过心内出血或尾腔静脉放血完成的。

对于小鼠的心内方法，您需要一个带有 3 -22 号 1 英寸针头的 25 cc 注射器。对于大鼠，首选带有 10 号 12 号针头的 18-1.5 cc 注射器。请参阅下面的协议，了解为什么这些需求和注射器是理想的。

首先使用二氧化碳对动物实施安乐死。安乐死后，握住啮齿动物的骷髅，身体垂直悬挂。这种约束很关键，因为身体应该挺直，以防止心脏偏转或胸部扭曲。请注意，心脏大约位于肘部水平。插入侧位于剑突左侧的切槽中，平行于脊柱和肋骨下方。

将针头向上斜切插入胸部并刺穿心脏。用注射器施加轻微的背压。如果针头在心脏中，血液会流入注射器。等到血液充满枪管后，再添加额外的背压。通过心脏穿刺可以从小鼠或大鼠收集大约一半的总血容量。这相当于一只普通小鼠的大约 1 mL 血液和一只普通大鼠的大约 10 mL 血液

使用外侧入路时，另一种姿势是背侧卧位。在这种情况下，将针头放在动物左侧的肋骨之间。入口点是针对肘部在胸壁上的点测量的。将针头向上倾斜，垂直于桌子平面插入胸壁中间的一点。用注射器施加轻微的背压。如果针头在心脏中，血液将流入注射器。同样，等到血液充满枪管后，再添加额外的背压。请注意，无论哪种位置，过大的背压都可能使心脏塌陷，从而阻塞针头斜面并阻止血液流入注射器。

另一种采集心脏血液的方法是通过腔尾静脉。此过程所需的设备是带有正确尺寸针头的合适注射器;用于打开腹腔的剪刀、小型无创伤拇指镊子和纱布海绵。该技术要求在整个手术过程中对动物进行深度麻醉并保持麻醉。CO2 麻醉不是一种选择，因为动物心脏必须跳动才能进行此手术。将动物置于背卧位，并将四肢固定在平台上。四肢应从身体向外伸展。

现在用镊子提起皮肤，然后用剪刀在女性骨盆或男性包皮上方的皮肤上做一个小的横向切口。接下来，将剪刀的尖端放入切口中，从骨盆或包皮到剑突穿过皮肤做一个中线切口。在皮肤横向反射的情况下，抬起肌肉并在皮肤切口上方的肌肉上做一个小的横向切口。

将剪刀的尖端放入腹部，然后通过肌肉做一个中线切口到剑突。确保剪刀尖向上倾斜，以防止割伤任何器官。沿每侧肋骨的曲线横向切割。小心不要刺穿肝脏。轻轻地将肠道移动到动物的左侧，露出后腔静脉。将纱布垫放在肝脏上，然后将食指和中指放在上面。用另一只手插入针头，斜向腔静脉，位于肾血管交界处和髂分叉处之间。慢慢抽出血液，同时对肝脏施加压力。

避免手部移动，因为这可能会导致血管破裂。此外，过快的血液抽吸会导致血管塌陷到斜面上，堵塞开口并阻止血液收集。这种技术的主要优点是能够收集无菌样本，因为针头不会穿过皮肤。

最后，让我们看看这些抽血技术的一些应用。免疫肿瘤学是一个新兴领域，该领域的研究人员经常进行采血以研究癌症发展不同阶段的免疫细胞。例如，研究人员从荷癌小鼠身上收集心脏血液，以分离和量化肿瘤植入后第 10 天、第 20 天和第 30 天的中性粒细胞。

另一方面，生理学家也经常研究血液成分。与这项研究一样，研究人员对评估糖尿病动物的肾功能感兴趣。为了做到这一点，这些科学家首先将一种染料注射到糖尿病动物模型中。接下来，他们使用尾剪法在几个时间点采集血液，以评估血液中的染料浓度，最终用于计算肾小球滤过率，突出糖尿病诱导后肾功能的差异。

最后，干细胞研究人员使用血液样本来评估供体细胞成功整合到受体系统中的情况。在这里，研究人员首先通过尾静脉注射将雄性小鼠的骨髓细胞移植到野生型和转基因雌性动物中。接下来，他们从受体小鼠的眶后窦收集血液，以使用聚合酶链反应研究血细胞的基因组 DNA。这提供了两种动物中供体细胞植入的百分比。

您刚刚观看了 JoVE 关于抽血技术的第一部分。请观看该系列的下一个视频，回顾如何在实验动物中执行其他常用的血液采集技术。一如既往，感谢您的观看！