癫痫突变体中癫痫发作的神经环路检测方法 果蝇

开始此神经回路实验时，先将果蝇固定在牙科蜡上。在载玻片上，将四个电极插入果蝇体内：一个接地电极插入腹部，一个记录电极插入胸部的背纵飞行肌，以及两个刺激电极插入头部。

通过寻找巨大纤维的阈值并观察是否有可见反应来确认电极的放置位置。对果蝇施加所需电压的高频波序列，若未发生惊厥，则示波器上的波形将保持平坦。若发生惊厥，则波形会显示出对高频刺激的无控制性电活动反应。

大家好，我是加州大学伯克利分校环境科学政策与管理系的教授 Mark Toay。今天我们将向您展示一种检测果蝇电生理癫痫发作的方法。在我们的实验室中，利用该方法研究果蝇突变体的癫痫发作现象，并测定这些突变体的癫痫发作阈值。

那么，让我们开始吧。实验前一晚，将所需基因型的雄性果蝇用二氧化碳麻醉，并转移至装有新鲜培养基的试管中，管口用柔软的尼龙塞或棉球封住。由于二氧化碳麻醉会改变果蝇的惊厥阈值，因此麻醉后至少应静置六小时，过夜静置效果更佳。

在实验当天，将果蝇逐一固定在载玻片上，载玻片一侧涂有一层牙用蜡。操作果蝇时不使用麻醉，而是用连接真空管路的钝化23号针头夹住果蝇头部将其提起，随后将果蝇的腿和翅膀压入牙用蜡中，固定于载玻片上。

一旦果蝇被固定，将石蜡推至其颈部和眼部周围，以完全固定头部。此时果蝇已安装完毕，可进行电生理记录。电生理实验装置包含三组显微操作器，每组连接一至两根锋利的钨电极。

钨电极裸用，无需盐水。电压由刺激器提供，刺激器连接至与刺激电极相连的隔离单元。记录电极连接至前置放大器，前置放大器再连接至数字存储示波器。

虽然并非必需，但将扬声器连接到示波器上以使反应信号可听化会非常有用。将固定好的果蝇置于显微镜载物台上，并将接地电极插入果蝇的腹部。记录电极则插入果蝇胸部的一条背侧纵肌中。

经过 sharpened 的电极足够坚固，可刺穿外骨骼。若操作得当，电极偶尔会弯曲，需要更换。刺激电极通过头部表皮插入，位置位于复眼与触角之间的间隙处。

现在已准备好进行记录的果蝇。接下来，准备用于记录的仪器。刺激器的设置应为：每个脉冲之间设定持续的2秒脉冲间隔，脉冲延迟为零，脉冲宽度不超过0.2毫秒。

示波器应开启存储功能，并设置如下参数：时间每格应设为每格1毫秒，每格电压稍后应设为每格100毫伏。

如果响应强度不够理想，可将此设置更改为每格50毫伏。通过施加电压逐步增加的单个电脉冲，并记录在记录电极中引发响应所需的最低电压，来确定巨大纤维的阈值。该测量值通常约为2伏。

一旦确定了巨大纤维的阈值，停止对果蝇施加脉冲，并将Oslo示波器的设置更改为每格0.2秒。接着，更改刺激器的设置：将脉冲间隔设为单个脉冲，并启动脉冲序列。

将波形参数设置为0.5毫秒脉冲，频率200赫兹。持续300毫秒后，电压调整至所需设定值，并向果蝇大脑输送高频脉冲串以诱发癫痫发作。脉冲串刺激结束后，示波器轨迹将显示一个平坦成分。若此时未诱发癫痫发作，可迅速将参数恢复至记录开始时的设置，此时单个脉冲将引起巨纤维系统的反应。

如果诱发了癫痫发作，示波器将在电刺激串结束后显示出类似癫痫发作的电活动。此时，若迅速将设置恢复至原始参数，单个脉冲将无法在巨纤维系统中引发反应。

果蝇在受到高频刺激波列后会进入一个不应期，在此期间无法诱导出类似癫痫的活动。如果没有发生癫痫，果蝇的不应期大约持续七分钟；如果已诱导出癫痫发作，则在癫痫发作结束后，果蝇的不应期大约持续17分钟。

可在同一果蝇上施加额外的高频刺激，电压可高于或低于前一次刺激序列，直至确定惊厥阈值，或直至巨型纤维反应过弱而无法观察到；若出现后者情况，则必须弃用该果蝇并重新开始实验。实验完成后，将果蝇从电生理装置中取出，从石蜡中释放，并妥善处理电极位置正确的废弃果蝇。在选定电压下施加高频刺激可能引发类似惊厥的活动，但并不一定发生惊厥。

刺激后的迹线立即呈现平坦状态。若发生癫痫发作，迹线将显示出不受控制的电活动。我们刚刚向您展示了如何利用电生理学方法在果蝇中检测癫痫发作。

使用该检测方法时，必须正确固定果蝇，以便电极能够顺利插入。电极放置不当是该检测中最容易引发问题的原因。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。