成年大鼠心脏心肌细胞的原代培养

在本文中，我们描述了一个典型的成年大鼠心脏心肌细胞分离和培养。胶原酶和蛋白酶消化，分离单个心肌细胞。心肌细胞培养遵守此协议满足大多数实验要求。

该过程首先从成年大鼠身上切除心脏并将其挂在灌注系统上。让酶溶液灌注约 30 分钟，然后取出心脏。切碎和酶消化允许在小烧杯中继续进行。

在消化结束时，通过机械搅拌将细胞解离成单细胞悬液，并过滤到无菌管中。将原代心脏细胞在钙浓度增加的缓冲液中洗涤 3 次，重悬于培养物、培养基中并接种在层压涂层的组织培养皿上。大家好，我是来自哥伦比亚大学生理学和细胞物理学系 Henry Cowa 实验室的 Shahi。

今天，我们将向您展示分离和培养其他大鼠心脏细胞的程序。我们在实验室中使用该程序来研究心脏中的钙通道。那么让我们开始吧。

大鼠手术前一天确保所有溶液都已制成，但不要添加任何酶。缓冲液 a、b 和洗涤缓冲液在 4 摄氏度下储存前，均应过滤无菌。6 孔组织培养板也必须在前一天接种层压溶液，并在 37 摄氏度下储存在 CO2 培养箱中。

手术当天。用 70% 乙醇对夹子剪刀和镊子进行消毒来准备手术器械，然后在纸巾上晾干。准备好一个装满半毫升肝素溶液的 1 毫升注射器。

现在，最好用反向蠕动泵清洗流经 70% 乙醇的灌注仪。完成后，用乙醇冲洗，用双蒸水冲洗设备，最后用缓冲液 A 冲洗。将流出物收集在烧杯中并置于 37 摄氏度的水浴中。为了准备清理后的充血装置，在右侧注射器管中填充 40 毫升缓冲液 A，在左侧注射器管中填充 40 毫升缓冲液 B，让缓冲液 A 流过装置，将灌注管灌注到导管尖端。

将缓冲液重新填充到注射器中至 40 毫升水平。确保在此步骤后管道中没有气泡，现在关闭缓冲液、带有旋塞阀的注射器并重复该过程，以便现在用缓冲液 B 灌注大量管道。B 旋塞阀打开，但流量停止。

使用 IV 管路上的调节器，丢弃收集烧杯中流过的缓冲液。手术前要做的最后一件事是将所需的酶添加到储备溶液中，然后像前一天过滤其他溶液一样过滤酶溶液。过滤后，该溶液可以按照标准方案在室温下放置。

在毒气室中用异氟对大鼠实施安乐死。用 70% 乙醇对胸部的切口区域进行消毒。用剪刀打开箱子，露出心脏。

用 0.5 毫升肝素溶液注射左心室。切除心脏，大部分主动脉完好无损。立即将导管插入主动脉。

典型的大鼠心脏应该产生高比例的健康杆状肌细胞和少量的死圆细胞。如果正确遵守以下程序，则开始将主动脉夹在导管上。导管尖端不应推入心脏太远，以确保心脏通过冠状动脉的良好灌注。

夹紧后，用缝合线将主动脉系在导管上。接下来，打开 IV 管路调节器以允许快速滴速，并允许缓冲蜂在缓冲蜂洗涤期间洗掉心脏。使用小剪刀和镊子去除心房和任何附着在心脏上的脂肪或肺组织。

缓冲液 B 完成后，将流切换到缓冲区一段时间。缓冲液 A 可流动 5 分钟。在 37 摄氏度的水浴中加热酶溶液。

当缓冲液 A 从注射器中耗尽但仍存在于管道中时，在浓缩装置的注射器 A 中加载 50 毫升酶溶液。现在有必要丢弃水浴中收集烧杯中的所有流出，直到酶溶液渗入心脏。一旦酶溶液渗入心脏，立即启动蠕动泵，该泵用于将酶溶液从收集烧杯转移到补充的注射器中。

A 让酶溶液流经心脏 10 分钟。当心脏消化时，当注射器 A 中的酶溶液中加入 37.5 微升 0.1 摩尔氯化钙时，它开始显得膨胀，从而得到 0.1 毫摩尔钙的有效浓度。这是几种氯化钙添加物中的第一种，用于在 10 分钟后增加浓度，通过向注射器 A 中额外添加 50 微升 0.1 摩尔氯化钙，将钙浓度增加到 0.2 毫摩尔，并让大量再进行 10 分钟。

10 分钟后，切掉心室，将心脏转移到一个无菌的小烧杯中，烧杯中含有 20 毫升酶溶液。再加入 40 微升 0.1 摩尔氯化钙，将钙浓度增加到 0.4 毫摩尔，用一把无菌小剪刀轻轻地将心脏切成 10 块或更多块。现在将烧杯在 37 摄氏度下轻轻摇动孵育。

孵育 5 分钟后，加入 40 微升 0.1 摩尔氯化钙，得到 0.6 毫摩尔钙的有效浓度，在 37 摄氏度下再孵育 5 分钟后，用塑料移液管轻轻迭代心块 3 至 5 次，加入 40 微升 0.1 摩尔氯化钙，并像以前一样轻轻迭代。使用无菌 500 微米过滤器将消化的单个肌细胞与未消化的结缔组织分开。让细胞在 50 毫升试管中在室温下沉淀 10 分钟 用转移 VI 快速丢弃上清液 将细胞轻轻重悬于 1 号洗涤缓冲液中，并让细胞在室温下沉淀 10 至 20 分钟，同时细胞沉淀。

取一小份等分试样，并以此时间为契机，在倒置显微镜下评估悬浮细胞的质量和活力。一个好的制剂将具有高比例的杆状细胞和清晰的条纹。细胞沉淀后，丢弃 snat 并将细胞轻轻重悬于洗涤缓冲液中。

第二，让细胞在室温下沉淀，这应该再次需要 10 到 20 分钟，然后弃去上清液。在将细胞转移到组织培养板之前，将细胞轻轻重悬于 5% 血清培养基中。用一个 XSFM 清洗板。

以所需密度转移细胞，并在 CO2 组织培养箱中孵育。将培养基换成 1 个 XSFM 细胞 3 到 5 小时，细胞可以培养长达 4 天，并根据需要用于实验。当方案正确完成时，在倒置显微镜下应该有超过 70% 的活心脏肌细胞。

这些是在培养 48 小时后用 YFP REM 转染的分离肌细胞。这种质量的细胞通常通过该程序培养。我们只会向您展示如何分离和培养是热细胞。

执行此程序时，请务必记住要尽可能快速和干净。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。