Name: 小鸡前OVO文化前OVO CAM含量:它是如何真正起作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 23 s
Description: 学习鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）离体培养技术，用于研究血管生成和肿瘤生长。该方法为癌症生物学研究提供了有效的活体模型，便于观察肿瘤行为动态变化。

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作者谨此感谢 J. Kueper 和 J. Wittschier 提供出色的技术支持，以及 Ruebben 教授慷慨提供肿瘤组织材料。

所有仪器和试剂必须购买无菌产品，或通过高温、蒸汽灭菌，或使用70%乙醇进行灭菌。
作者声明，动物实验严格遵循欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC），并依照美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理与使用的指南，以及德国杜伊斯堡-埃森大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）所制定的规定进行。
第1部分：卵的孵育
<ol>
 <li>受精卵可在13°C下保存长达一周。</li>
 <li>将鸡蛋水平放置于带有移动托盘的孵化箱中，持续每天旋转12次，孵化72小时。湿度保持在60 - 62%，孵化温度为37.5°C。 
注意：在开始孵化前，需使用表面粗糙而非柔软的普通灰色波纹手纸，通过干擦方式机械性地小心去除蛋壳表面的污物、羽毛和粪便。然而，无论使用何种液体，以乙醇或消毒剂擦拭鸡蛋均会显著降低胚胎的存活率。</li>
</ol>
第二部分：Ex ovo 培养
<ol>
 <li>孵育 72 小时后，将鸡蛋从培养箱中取出。 
注意：根据我们的实验结果，孵育 72 小时是因为——尽管原因尚不明确，但与 Auerbach 等人1 的早期研究一致——更早发育阶段的胚胎存活率显著降低。而在超过 72 小时的发育阶段，尚未被绒毛尿囊膜（CAM）覆盖的卵黄囊会变薄，并倾向于黏附于蛋壳，导致（i）黏附区域出现小范围出血，以及（ii）卵黄囊膜破裂。因此，本方法不适用于超过 72 小时的胚胎。</li>
 <li>用铅笔标记鸡蛋的顶部，即胚胎所在的一侧，因为胚胎在一定程度上会抵抗旋转。</li>
 <li>将鸡蛋水平持握，使铅笔标记位于上方，并在一根 80 mm 三角形磁力搅拌棒的边缘上敲裂，搅拌棒应垂直于鸡蛋的长轴放置。 注意：为了获得更好的手感，不应佩戴手套，但需用 70% 乙醇（EtOH）对手部进行消毒。关键是要将蛋壳和蛋膜均打开。蛋清外漏是蛋膜已被刺破的可靠标志。</li>
 <li>将鸡蛋保持靠近培养皿底部，以避免蛋清进一步泄漏。 
注意：在初始开壳过程中，重要的是培养皿底部的蛋清仍与蛋内其余部分相连，这样可在蛋内形成负压，使带有胚胎的卵黄保持在蛋内。该负压可通过手指施加压力控制空气进入蛋内，或通过抬高鸡蛋增加相连蛋清的液柱高度（即增强负压）来进行调节。</li>
 <li>通过拇指和中指轻轻按压穿过裂口并沿鸡蛋赤道线的子午线方向，可调节负压。随后，若轻柔地提起带有卵黄的蛋体，并小心分离蛋壳的两半，则可将内容物完整无损地转移至培养皿中。胚胎及卵黄血管应位于完整未破损的卵黄表面。 
注意：若未保持铅笔标记朝上，敲裂蛋壳时可能损伤胚胎。若敲裂操作不够轻柔，或胚胎超过 72 小时（见上文），卵黄囊会黏附于蛋壳并常发生破裂。当培养箱湿度低于 60%，或孵育期间未定期旋转鸡蛋时，也会出现相同情况。</li>
 <li>Ex ovo 培养的胚胎需放回培养箱，在 37.5°–38.2°C 及 60% 湿度条件下继续培养。若培养箱未完全密闭（通风格栅需部分打开！），并使用带有盖与皿之间间隔结构的特殊培养皿，则无需额外提供 CO2 或 O2。 
 注意：在孵育最初几天应尽量减少胚胎移动，过度震荡会导致高死亡率。自孵育第 9 天起，胚胎对震荡的敏感性降低。 
 死亡胚胎应立即移除，以防感染。 
 若使用完全密闭的细胞培养箱，则必须提供 O2 供应，否则胚胎将死亡。湿度对防止绒毛尿囊膜（CAM）干燥至关重要；若孵育温度低于 37°C，胚胎发育将过于缓慢。</li>
</ol>
第3部分：血管生成实验中物质的应用
<ol>
 <li>将已灭菌的折叠滤纸（直径5.5 mm）用打孔器打孔，作为施加于鸡胚尿囊膜（CAM）上液态物质的支撑材料（载体）。 
 注意：几乎所有载体材料（见下表）都会引起CAM刺激，尤其是在孵化第10天前施加时，会改变发育中CAM的血管结构。这包括一些看似惰性的物质，如羟乙基纤维素膜、聚四氟乙烯海绵（PTFE- pledgets）、胶原海绵、胶原膜、无菌纱布（棉签）、圆形盖玻片和硅胶环，这些均会导致假阳性结果。滤纸引起的刺激最小，因此在我们的实验中选用滤纸作为载体。</li>
 <li>当CAM完全发育后，可在单个CAM上施加最多6种不同的样品，并比较其效应。</li>
 <li>为防止滤纸干燥，应每天重新施加额外剂量（3 μg 天然血管活性物质）或缓冲液（5 μl PBS）。</li>
 <li>自施加后第3天起，血管开始朝向滤纸上促血管生成物质的方向生长，而对照组周围的血管模式则无变化。 
 注意： 不应将CAM与卵黄囊混淆。CAM是一个动态发育的结构，而卵黄囊则相对静止，在发育过程中变化甚少。在发育第3天，可在胚胎尾端首次观察到发育中的CAM，表现为一个小囊泡。从第3天到第10天，该初始囊泡不断扩展，形成一个折叠的双层膜结构，并以逐渐加快的速度覆盖卵黄囊。施加位点应位于胚胎与CAM折叠边缘（边界）之间的中点位置，否则胚胎会阻碍透射光下对效应的显微观察。此外，随着CAM持续生长，含有促血管生成物质的滤纸可能被内化。</li>
</ol>
第4部分：将细胞接种到绒毛尿囊膜上
4.1. 细胞的制备
<ol>
 <li>使用无菌的25 ml塑料移液管和移液器辅助装置，将汇合的细胞从培养瓶转移至FALCON管中。</li>
 <li>为估算细胞数量，取15 μl细胞悬液转移至血细胞计数板（Neubauer chamber），并在显微镜下手动计数细胞。</li>
 <li>Falcon管在室温下以1000 rpm离心3分钟，弃去上清液。</li>
 <li>对于活细胞示踪，将细胞用PBS稀释至所需浓度（此处为：2×107 cells/ml），并按照生产商说明书使用例如PKH26（Sigma）等红色荧光活细胞膜标记试剂盒对细胞进行染色。 
细胞重新悬浮于细胞培养基中（优先使用DMEM，即Dulbecco改良Eagle培养基），调整至注射所需浓度（107 cell/ml）或接种所需浓度（3×106 cell/ml）。注射与接种所用的细胞浓度不同，依据为文献已报道的浓度15-17及我们的实践经验。</li>
</ol>
4.2 将细胞接种到尿囊绒毛膜上
<ol>
<li>使用锋利的手术刀从1 ml移液器吸头或外周静脉导管（PVL）管上切下环状物（厚度约1 mm），并将其应用于培养的E6-E14鸡胚尿囊膜（CAM）上 体外孵化. 
 注意尽量避免多次“锯”切，应使用新的非常锋利的手术刀一次性切断移液器吸头或导管管壁，以防止所制环状物产生锐利边缘。在显微镜下检查环状物是否存在因微裂纹导致的锐边。</li>
<li>根据环的大小 20 μl 3×10的6 将细胞以总细胞数或分装至多个环形区域的方式，用移液器加入。 
 注意在某些情况下，需通过轻柔刮擦对CAM进行创伤处理，例如以促进细胞接种17 以及移植物的毛细血管化（见下文）。然而，如果实验不希望或不宜对CAM造成创伤，例如在研究肿瘤细胞侵袭潜能时，则不应使用环状物接种，而应直接接种细胞，因为使用环状物或环状物本身可能诱发微小损伤。若必须使用环状物，应将其切割至尽可能薄，以减轻重量并避免对CAM造成压痕。</li>
</ol>
第5部分：细胞的玻璃体内注射
<ol>
 <li>使用70%乙醇冲洗Hamilton微升注射器数次，最后用无菌PBS冲洗。</li>
 <li>将制备好的染色或未染色细胞悬液吸入微量注射器中（参见第4.1部分）。 
注意： 注射位点必须谨慎选择，避免因针头刺入过深而损伤CAM的血管或胚胎邻近结构（如脑组织）。注射操作应在解剖显微镜下进行。 </li>
 <li>在显微镜控制下，小心但迅速地用注射针头穿透CAM和眼球各层，并持续注射10至最大量 20 μl 细胞悬液（最好用PBS稀释）注入培养的鸡胚玻璃体中 体外培养. 
注意： 如果尿囊绒毛膜无法用针头穿透，可使用两把镊子在血管较少或无血管的部位轻轻撕开将其移除。</li>
 <li>针头应留在眼内1-2秒，以避免注射的细胞悬液因渗漏而损失。</li>
</ol>
第6部分：鸡肢芽的解剖
<ol>
 <li>孵化3至4天后（E3/E4 = 哈amburger Hamilton（HH）18-23期）从培养箱中取出鸡蛋 </li>
 <li>将鸡蛋敲击在三角形磁力搅拌棒的边缘，转移至培养皿中（详细步骤见第2部分），使用弹簧剪刀沿圆形切开，将胚胎从相连的卵黄血管中解剖分离。</li>
 <li>将胚胎用小引流勺转移至盛有冷的无菌PBS的新鲜培养皿中，并通过轻柔振荡进行清洗。</li>
 <li>将胚胎转移至盛有无菌PBS的小型培养皿中，用精细镊子小心撕开并去除周围的膜结构。</li>
 <li>肢体芽通过显微外科镊尽可能靠近躯干处切下，夹取并转移至培养的8-10日龄宿主鸡的绒毛尿囊膜上 体外培养法 （参见嫁接步骤）。</li>
</ol>
第7部分：小鼠肢芽的制备
<ol>
 <li>设定定时交配的妊娠实验，将雌性小鼠检测到阴道栓的当天早晨定为妊娠第0天。</li>
 <li>通过颈椎脱位法处死胚胎发育至胚胎期（E）10至13天的怀孕雌性小鼠，并将其固定于石蜡板上。</li>
 <li>用70%乙醇湿润腹壁，沿中线切开，并用针将皮瓣向侧方固定。</li>
 <li>将子宫的两个角从腹腔中取出，分离后转移至含有冷PBS的烧杯中。</li>
 <li>将胚胎分离后转移至培养皿中，用镊子小心去除子宫壁和胚胎膜。</li>
 <li>肢芽使用弹簧剪刀剪下，或用精细镊子尽可能靠近躯干处剥离，夹取后转移至培养的8-10日龄鸡胚尿囊膜上 体外孵化 （参见嫁接步骤）。</li>
</ol>
第8部分：肿瘤样本的采集
<ol>
 <li>肿瘤活检样本收集于含有肿瘤细胞特异性培养基（此处为Leibovitz's培养基）的2 ml Eppendorf管中，并于室温保存。</li>
 <li>肿瘤活检组织使用无菌手术刀切成 1-2 mm³ 的小块。 
注意如果肿瘤样本过小，可能无法附着于绒毛尿囊膜（CAM）；如果过大，则可能损伤CAM，导致胚胎死亡。</li>
 <li>将活检样本核心组织的一小块移植到培养的8-10日龄宿主鸡的绒毛尿囊膜（CAM）上 体外孵化 （参见嫁接步骤）。 
 注意取材于活检组织表面会增加肌肉或结缔组织污染的风险。</li>
</ol>
第9部分：嫁接操作步骤
<ol>
 <li>对于肢芽或肿瘤标本的移植，采用培养8至10天的鸡胚完全发育的绒毛尿囊膜（CAM） 体外孵化 被使用。 </li>
 <li>移植物应理想地放置在血管Y形分叉附近的CAM上。</li>
 <li>在目标应用部位，用镊子轻轻刮除双层上皮的上层表皮部分，选择性地损伤CAM，同时保持基底层完整。 
 注意必须避免出血或毛细血管出现可见的破裂。</li>
 <li>将移植物转移至CAM时，仅保留少量PBS。根据移植物类型，可先将其在CAM非目标区域放置一次或两次，以去除多余的PBS，最后将其移植至预先准备好的受损CAM部位。</li>
 <li>用精细镊子夹住移植物，并将其分层放置在尿囊膜（CAM）上。根据移植物的敏感性，可施加轻微压力（不 适用于肢芽）以将移植物操纵至CAM形成的凹陷处（适用于肿瘤样本）。 
 注意：由于鸡的免疫系统在胚胎发育第18天（E18）时已开始发育， 体外 异种移植培养不应超过E17，因为宿主鸡胚经常死亡。 
 必须准备好相应的宿主CAM，即培养的鸡胚 体外培养， 与您选择的供体组织来源时间相匹配。</li>
</ol>
第10部分：重新移植
<ol>
 <li>通过断头法处死宿主鸡胚。</li>
 <li>用尖头剪刀做环形切割，取下附有移植物的绒毛尿囊膜（CAM），并转移至盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。</li>
 <li>除原附着部位外，使用弹簧剪刀剪去移植物上多余的绒毛尿囊膜组织。</li>
 <li>对于较大的肿瘤样本，将移植物切成两半或多个较小片段，并将切面朝向第二只宿主的新绒毛尿囊膜进行再移植。</li>
</ol>
第11部分：代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig1.jpg" alt="胚胎发育、鸡胚发育阶段E6-E17、血管生成、显微镜图像、血管生长。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 无壳鸡胚培养 
在培养皿中进行体外（ex ovo）培养的不同发育阶段的鸡胚胎。
<img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig2.jpg" alt="血管生成分析，鸡胚，显微镜图像，PBS对照组与天然血管活性蛋白随时间变化的比较" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. Ex ovo CAM 血管生成实验 
受精鸡卵在37 °C、湿度60 - 62%条件下水平孵化，并于胚胎发育第4天（E4）转移至培养皿中。继续在相同条件下孵育。在E10时，将无菌滤纸片（直径5.5 mm）置于CAM上，并分别加入5 μl PBS或3 μg天然血管活性蛋白6。到E14时，毛细血管明显向含血管活性蛋白的滤纸片方向排列。
<img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig3.jpg" alt="鸡和小鼠肢芽发育；显微镜观察，腹面视角，苏木精-伊红染色，胚胎比较" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 体外孵化 肢芽移植 
将鸡（E3/E4）和小鼠（E13）的肢芽移植到无壳鸡胚的绒毛尿囊膜（CAM）上。移植两天后，来自CAM的血管进入肢芽。这些肢芽的发育在无壳鸡胚培养系统中持续进行 体外孵化 培养物在鸡胚中达到两个指节阶段，并在小鼠肢芽中显示出指间网状结构的减少。
<img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig4.jpg" alt="鸡胚发育示意图；背侧与腹侧视图，血管生长，4倍放大。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 体外孵化 肿瘤样本接种 
将膀胱癌的活检样本接种于培养的10日龄鸡胚尿囊膜上 体外孵化培养两天后，肿瘤标本与CAM血管系统相连，7天后可观察到多条血管进入移植物。

<ol><li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
<li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+development+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).</li>
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</ol>

是创新，还是又一种普通的鸡胚培养方案？
既往的无壳培养方案1-4中，鸡胚的总体存活率较低，例如约30%1。相比之下，本视频文章所描述的优化后ex ovo培养方案可实现超过50%的存活率。与经典的in ovo培养相比，ex ovo培养显著提高了鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）及鸡胚本身的可及性，便于对其进行实验操作和连续观察。该培养方法适用于多种应用，范围涵盖增强型血管生成检测5,6、鸡胚眼球玻璃体的便捷注射7-9、内渗实验10-12、肢体芽移植与生长的优化13，以及肿瘤样本的创新性维持培养14。因此，ex ovo培养为发育生物学、血管生成及肿瘤研究提供了一种有用的工具。

<table><tbody><tr><td>受精卵</td><td>动物</td><td>Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠</td><td>动物</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带旋转蛋盘的3000型孵卵器</td><td>工具</td><td>Siemens AG</td><td>9503</td><td>维持在37&amp;#x00B0;C，相对湿度保持在60%以上</td></tr><tr><td>Grumbach BSS 160 型蛋孵箱</td><td>工具</td><td>Grumbach, Germany</td><td>8101</td><td>维持在37-387deg;C，相对湿度保持在60%以上</td></tr><tr><td>PBS</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>PBS 应为冷的（&lt;strong&gt;&amp;gt;&lt;/strong&gt; 4&amp;#x00B0;C）且无菌</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良鹰&amp;rsquo;s 培养基</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 6429</td><td>DMEM 培养基</td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 培养基</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>31415-029</td><td>此处：用于肿瘤样本的收集培养基</td></tr><tr><td>肿瘤细胞特异性培养基</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>各研究组应使用其常规培养肿瘤细胞所用的培养基，或通用培养基，例如 Leibovitz&amp;rsquo;s 培养基或 Dulbecco&amp;rsquo;s 改良鹰&amp;rsquo;s 培养基&lt;br/&gt;补充15%胎牛血清（FBS）、4 mM L-谷氨酰胺和50 &amp;#x03BC;M 胰岛素</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三角形磁力搅拌子，80 mm</td><td>工具</td><td>VWR international</td><td>442-0391</td><td>三角形磁力搅拌子适用于敲裂蛋壳</td></tr><tr><td>DUMONT #5 镊子</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>斜面极细杆部（0.05 mm × 0.02 mm 尖端）</td></tr><tr><td>DUMONT #7 镊子</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>弯曲杆部（0.07 mm × 0.10 mm 尖端）</td></tr><tr><td>弹簧剪刀，直型，8 cm</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>细小直刃</td></tr><tr><td>精细虹膜剪刀，直型</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>用于切除CAM</td></tr><tr><td>标准剪刀，直型，锐/钝</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>14007-14</td><td>用于断头或颈椎脱位</td></tr><tr><td>微量注射器 1702 TLLX，25 &amp;mu;l</td><td>工具</td><td>Hamilton Co</td><td>80222</td><td>用于玻璃体内注射</td></tr><tr><td>Hamilton 33-G 针头（15 mm）</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>18073-15</td><td>用于玻璃体内注射</td></tr><tr><td>无菌手术刀片</td><td>工具</td><td></td><td></td><td>用于解剖肿瘤样本</td></tr><tr><td>小型引流勺</td><td>工具</td><td>Geuder</td><td>15758</td><td>用于转移小型鸡胚</td></tr><tr><td>带固定针的蜡板</td><td>工具</td><td>自制</td><td></td><td>用于固定动物以进行解剖</td></tr><tr><td>培养皿 60 × 15 mm</td><td>工具</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 92 × 16 mm</td><td>工具</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>82.1472</td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿 100 × 20 mm</td><td>工具</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>特深型，带通风间隔柱</td></tr><tr><td>烧杯</td><td>工具</td><td></td><td></td><td>300–600 ml</td></tr><tr><td>FALCON 管</td><td>工具</td><td>Falcon BD</td><td></td><td>15 ml 和 50 ml</td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>工具</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>1.5 ml 和 2 ml</td></tr><tr><td>1 ml 移液器吸头</td><td>工具</td><td></td><td></td><td>用于切割塑料环以施加物质/细胞</td></tr><tr><td>外周静脉导管（PVL）</td><td>工具</td><td>Viggo&amp;#174;</td><td></td><td>用于从导管上切割硅胶环以施加物质/细胞</td></tr><tr><td>移液器及吸头</td><td>工具</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>已灭菌折叠滤纸 595 1/2，直径 110 mm</td><td>工具</td><td>Schleicher Schuell</td><td>311643</td><td>载体，对CAM刺激最小；论文中使用</td></tr><tr><td>PTFE棉片，不可吸收，6.3 × 152.4 × 1.6 mm</td><td>工具</td><td>santec-medical</td><td>REF 277, LOT 832/511-1</td><td>载体；导致假阳性结果</td></tr><tr><td>羟乙基纤维素 Tylose H 100000</td><td>试剂</td><td></td><td></td><td>与Kollidon 17 PF混合使用；导致假阳性结果</td></tr><tr><td>Kollidon 17 PF</td><td>试剂</td><td>BASF</td><td>S30200</td><td>与羟乙基纤维素混合；导致假阳性结果</td></tr><tr><td>胶原蛋白基质 TissuDura</td><td>工具</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>REF B2246000999999</td><td>载体；导致假阳性结果</td></tr><tr><td>圆形玻璃盖玻片，11 mm</td><td>工具</td><td>Assistent Germany</td><td>1001/0011</td><td>载体；导致假阳性结果</td></tr><tr><td>牛胶原海绵</td><td>工具</td><td>Wyeth Animal Health</td><td></td><td>载体；导致假阳性结果</td></tr><tr><td>Resodont 可吸收胶原膜</td><td>工具</td><td>Resorba Woundcare Germany</td><td>LOT 280303</td><td>载体；导致假阳性结果</td></tr><tr><td>无纺布棉片</td><td>工具</td><td>Fink Walter GmbH</td><td>REF 328132</td><td>载体；导致假阳性结果</td></tr></tbody></table>

小鸡 ex ovo 培养与 ex ovo cam 检测：其工作原理详解

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

在孵化早期的鸡胚蛋介于体外（in vitro）与体内（in vivo）系统之间，提供了一个具有血管结构的实验环境，不仅可用于研究血管生成，也可用于研究肿瘤发生。随着鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）的发育，其血管网络可被便捷地接近、操作和观察，因此是进行血管生成检测的理想模型。由于鸡胚的淋巴系统在孵化后期才完全发育，鸡胚天然处于免疫缺陷状态，能够支持同种或异种移植物的生长，且不受物种特异性的限制。除了支持异源和异种移植物的发育外，CAM 的血管网络还为肿瘤细胞的内渗、播散、血管内滞留提供独特的支持性环境，并作为滞留细胞外渗并形成微转移灶的储存场所。
出于实验目的，在最近的大多数研究中，通过在蛋壳上切开一个窗口暴露尿囊绒毛膜（CAM），并在蛋内（in ovo）进行实验，这种方法显著限制了对CAM的可及性，也限制了对效应的观察和拍照记录。当采用无壳培养鸡胚时1-4，未提供详细的实验信息，即使有发表，这些培养体系的存活率也较低。我们通过引入一种合理可控的蛋内容物挤出方法，显著改进了鸡胚的蛋外（ex ovo）培养技术。这种ex ovo培养方式提高了CAM和鸡胚的可及性，便于对效应进行活体（in vivo）记录，并有利于对胚胎进行实验操作。该方法可成功应用于大量科学问题：（1）作为改进的血管生成检测模型5,6；（2）为鸡胚眼球玻璃体内的注射操作提供便利的实验设置7-9；（3）作为测试环境，用于研究接种于CAM上的已建立细胞系来源的分散肿瘤细胞的播散与内渗过程10-12；（4）作为改进的维持系统，成功用于鸡和小鼠肢芽的移植与培养13；以及（5）在CAM表面移植、扩增并再移植来自活检获取的实体原发性肿瘤组织14。
在本视频文章中，我们介绍了建立改良的鸡胚 ex ovo 培养及绒毛尿囊膜（CAM）检测方法，其存活率超过50%。此外，我们逐步演示了 ex ovo 培养技术在大量科学研究应用中的成功使用。 
Daniel S. Dohle、Susanne D. Pasa 和 Sebastian Gustmann 对本研究的贡献相同。

鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）是一种独特的天然免疫缺陷性支持培养环境，可用于研究血管生成和肿瘤发生。本视频文章展示了鸡胚ex ovo培养的不同步骤、潜在促血管生成物质的应用，以及在CAM表面成功接种肿瘤细胞和组织的方法。

小鸡 ex ovo 培养与 ex ovo CAM 检测：其工作原理详解

早期培育阶段的鸡胚介于体外与体内系统之间，不仅为研究……提供了血管测试环境

大家好，我是苏珊·帕（Susan Paa）。我来自德国布尔格埃森大学生理化学研究所的生化内分泌学系。大家好，我是丹尼尔·泽·巴西安·多尔（Daniel Ze Basian Dole）。我和苏珊来自同一机构。大家好，我是来自布尔格大学神经解剖研究所解剖学系的Mann。我们将向您展示CH X培养和共膜实验的具体操作方法。现在让我们进入实验室。在大多数近期的实验研究中，通过在蛋壳上切开一个窗口来暴露尿囊绒毛膜（CAM），并在蛋内进行实验，这种方法在CAM的可操作性以及对效应的观察和摄影记录方面存在显著局限性。鸡胚的蛋外培养技术则极大地提高了CAM和鸡胚的可及性。请观察跳动的心脏，以便于对胚胎进行体内效应观察和实验操作。在我们的视频文章中，我们将逐步演示如何成功应用离体培养技术来回答大量科学问题。鸡蛋被放置在带有移动托盘的培养箱中进行孵育。在此可以看到加热元件和托盘移动装置每天连续旋转鸡蛋12次。通过向孵化箱底部的塑料容器中加水，使湿度保持在60%；在开始孵化前，将孵化温度设定为37.5摄氏度。蛋壳上的污物、羽毛和排泄物需仔细清除，但使用乙醇或消毒剂机械擦拭鸡蛋会显著降低胚胎的存活率。将鸡蛋水平放置在孵化箱的移动托盘上。请确保各枚鸡蛋之间留有足够间距，以保证其可自由旋转。孵化72小时后，将鸡蛋从孵化箱中取出，并用铅笔标记出含有胚胎的鸡蛋顶端。由于胚胎在一定程度上具有抗旋转性并会保持在此位置，为了获得更好的触感，破壳时不应佩戴手套，但需用70%乙醇对双手进行消毒。将鸡蛋水平握住，使铅笔标记朝上，并在三角形磁力搅拌子的边缘处破壳。为在破壳过程中实现最佳力度控制，肘部不应倚靠在实验台面上。破壳时必须打开蛋壳及蛋膜，蛋清泄漏是蛋膜已被刺破的可靠标志。将鸡蛋保持靠近培养皿底部。在初始打开过程中，为避免蛋清进一步漏出，需确保培养皿底部的蛋清仍与蛋内其余部分相连。由于蛋内会因此形成真空，从而借助拇指和中指轻轻按压穿过裂口及蛋体赤道线的中线，可使蛋黄固定在原位，通过此方式可调节真空程度及蛋内容物的挤出。随后可将蛋内容物转移至培养皿中，确保蛋黄完整无损。若轻柔地提起鸡蛋并小心分离蛋壳的两半，则可将蛋外培养物置于托盘上，放回培养箱中，在37.5至38.2摄氏度及70%湿度条件下培养。无需提供二氧化碳或氧气供应。若使用带有盖子与培养皿之间垫片的特殊爱国者培养皿，以及带有通风网格的培养箱，则通风网格应保持半开状态。将液体物质施加到绒毛尿囊膜（cam）时，应使用高压灭菌滤纸作为支撑材料，因为此类滤纸对绒毛尿囊膜的刺激性最小。施加部位应位于胚胎与绒毛尿囊膜边缘之间的中点位置，否则胚胎会妨碍在透射光下对效应进行显微观察。此处的阿托品液体应在滤膜放置到角膜缘后立即滴加，以避免干燥。每天需重新滴加额外剂量或缓冲液。当角膜缘完全发育后，最多可施加六种不同的样品，并可在单个角膜缘上比较其效应。应从1毫升移液器吸头切割出环状结构，切得越薄越好，以减轻重量并避免对角膜缘造成压痕。然后将环状结构套在鸡胚尿囊膜上，再用移液器将细胞加入该环内。使用70%乙醇反复冲洗Hamilton微量注射器数次，最后用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗。用制备好的细胞悬液充满微量注射器，迅速而小心地将注射器针头刺入鸡胚尿囊膜及眼球各层，并持续注入细胞悬液。注射后针头应在眼内停留数秒，以防止细胞悬液因渗漏而流失，随后通过X-Ovo检查确认注射效果。采用孵育三天的鸡胚卵作为肢芽供体。将胚胎从连接的卵黄血管上解剖下来。通过切割一个圆形，使用小引流勺将胚胎转移至盛有冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，并通过振荡洗涤。随后将胚胎转移至盛有无菌 PBS 的新培养皿中，用精细镊子小心撕开周围膜结构，使胚胎游离。尽可能靠近躯干处用镊子摘下肢芽，夹取后转移至8到10日龄宿主鸡的绒毛尿囊膜（cam）上。在目标接种部位，用镊子的一侧轻轻刮擦，对绒毛尿囊膜进行选择性创伤处理。然后用持针器的另一部分夹住移植物，并将其分层放置在凸轮上。将供体雌性小鼠固定在板上。用70%乙醇润湿腹壁，沿中线剪开，用针将皮瓣向侧方固定。将子宫从腹腔中取出，分离后转移至含有冷PBS的烧杯中。为演示目的，使用镊子小心去除胚胎膜。此处展示的是一个16天大的小鼠胚胎，以便更清楚地观察肢芽。只有使用10至13天大的胚胎肢芽时，才能获得最佳的移植效果。肢芽需尽可能贴近躯干处剪下，或使用精细镊子操作。在预期的应用部位，用镊子轻轻刮擦以选择性地损伤 CAM。然后抓住肢芽，并将其转移至 8 到 10 日龄的宿主鸡胚的 CAM 上。将移植物放置于 CAM 的一侧一至两次，该侧并非最终移植位置，以去除多余的 PBS。移植物应理想地放置在血管肿瘤分叉呈Y形的冠状突附近。使用无菌手术刀将活检组织切成1至2立方毫米的组织块。从活检组织表面取材会增加被肌肉或结缔组织污染的风险。在目标应用部位，通过轻柔刮擦选择性地损伤CAM。取活检样本核心部分的一小块组织，移植到8至10日龄宿主鸡的CAM上。移植物应理想地放置在靠近血管Y形分叉处的CAM上。然后将移植物转移到绒毛尿囊膜上，尽量减少附着的PBS。可施加轻微压力，以使移植物进入绒毛尿囊膜的凹陷处。通过断头法处死宿主鸡胚。通过环形切割将带有移植物的尿囊膜切除，并转移至盛有PBS的培养皿中。除先前的附着部位外，移植物上多余的尿囊膜被切除。再次在所需的应用部位进行操作。通过轻柔刮擦选择性地损伤新宿主雏鸡胚胎的绒毛尿囊膜，并将移植物转移到第二个宿主的绒毛尿囊膜上，仅保留少量PBS。我们刚刚展示了CHX或培养技术的实际操作方法。我向您说明了与体外实验相比的优势，并提供了一些应用实例。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

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生物学

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