在体内的器官型小鼠视网膜Wholemount文化
January 11th, 2010
此视频文章演示器官视网膜wholemount文化和cytospin一个外生的诱导效应分析程序的建立。器官型视网膜wholemount文化模仿在体内情况，同时规避经典的小鼠动物模型的缺点，大大促进了实验操作的小鼠视网膜的无障碍。
嗨，我叫 Nicole Dunca。我是德国 D book ASIN 大学解剖学研究所神经系的主任。嗨，我是神经解剖学系 Dunca 教授实验室的博士生。
今天，我们将向您展示一个方便的系统，用于将接近 NI 情况的神经视网膜培养为器官型视网膜激素。所以让我们开始吧。基因靶向消融和动物模型分析是招募特定视网膜基因功能的经典策略。
然而，转基因小鼠模型通常显示早期岩性或患有严重畸形，从而无法进行胚胎期或出生后早期阶段的分析。原代细胞培养是在受控环境中研究外源应用重组因子影响的替代方法。解离细胞培养的优点是到达靶细胞的内源性信号减少，从而有助于识别外源性触发效应。
然而，重要的细胞相互作用在解离的培养物中被破坏。相比之下，器官型视网膜激素培养提供了一个接近生理体内情况的系统，神经元相互作用和连接仍然保留。在我们的视频文章中，我们提供了黑眼显微解剖的分步演示，包括去除晶状体和玻璃体。
15 天大的老鼠 Emyo 已被斩首杀死。通过使用细弯曲的镊子将眼睛成核，从眼窝中剥落冰块。出生后两天，年轻的老鼠幼崽被斩首杀死，直到出生后。
第 15 天，即小鼠睁开眼睛的时间点，必须使用镊子机械打开分离株。将细曲线镊子的尖端插入眼眶，并去除眼睛周围的结缔组织。与出生后第 2 天一样，眼眶骨仍然是软骨和柔软的。
重要的是在尝试去除眼睛时不要用镊子施加太大的压力。15 天大的小鼠幼崽被颈椎脱臼杀死。之后，分离株通过两次转移扩大，用弹簧剪刀切割。
然后，在弯曲的镊子的帮助下，眼睛成核，对眼眶施加压力并转移到培养皿中。使用 PBS，成年小鼠被颈椎脱位杀死，并且眼睛可以通过弯曲的镊子对眼眶施加压力直接成核。我们将展示胚胎第 15 天、出生后第 2 天、出生后第 15 天从左到右不同发育阶段的黑眼这一部分黑眼的特点，以及小培养皿中的成年眼。
使用无菌 PBS，解剖过程中必须去除周围的眼层，双前臂应放在工作台上。为了稳定手，转动眼睛，使晶状体部位朝向培养皿的底部。解剖胚胎眼时，发育中的视神经缓解眼睛的部位往往被结缔组织覆盖，需要通过非常细的镊子尖端将其切除，为进入视网膜和色素上皮之间的视网膜下空间创造空间，巩膜和色素上皮仍然非常柔软，易于去除。
但是，请确保完全去除玻璃体下方的三角形特伦特状毛细血管丛以及玻璃体。这种粘性神经丛很难在不损坏视网膜的情况下从剩余的视网膜杯中单独去除，但它会阻碍外源性物质过多地涂抹到视网膜层。在出生后第二天的药物作中，需要用镊子夹住眼睛后部的视神经。
周围的眼层，包括巩膜和色素上皮仍然柔软且易于去除。但要注意不要损坏视网膜。当通过视神经孔进入视网膜下间隙时，用两个镊子小心地向两侧撕裂，色素上皮与脉络膜和巩膜一起被去除。
然后将眼罩转向晶状体一侧，用镊子抓住晶状体和玻璃体。在撕裂时，眼罩与其他镊子一起固定 Place。在出生后第 15 天，在成核过程中，视神经经常保持附着在眼睛上，必须用镊子尽可能靠近基底夹住。
巩膜已经更紧密，因此进入视网膜下空间。在视神经被移除的孔处，巩膜、脉络膜和色素上皮的剥落变得比 P 2 更困难。剥去各层直到角膜水平，然后将眼罩转向晶状体部位，去除角膜以及色素、上皮、脉络膜和巩膜。
在用其他镊子托住剩余的视网膜杯的同时，用小晶状体抓住玻璃体，用镊子撕扯的同时，将视网膜激素支架与成人眼睛中的其他镊子保持在原位。与出生后阶段相比，需要被夹掉才能进入视网膜下间隙的视神经要粗得多。更透明剂非常坚固，用镊子穿透进入视网膜下空间将是解剖中的一个困难部分，将色素上皮与当前的膜一起撕裂，巩膜变得更硬，需要更多的控制力。
与胚胎眼相比，玻璃体的去除要容易得多，但玻璃体需要抓住两侧。不要用镊子的尖端刺穿玻璃体，因为其内容物会粘在镊子上，阻碍其去除。在开始培养之前，需要部分消化含有神经胶质细胞内膜和自限界膜的透明质酸酶，以促进外源性应用物质的渗透为此目的，管道 H 200 微升 pH 平衡，在 96 孔板的每个孔中含有每毫升透明质酸酶 0.5 毫克的改性 eagles 培养基，以转移视网膜主丘而不会损坏。
将1 毫升移液器的吸头切成几毫米以加宽开口，并通过插入和扭转第二个移液器吸头来平滑切割边缘。将视网膜激素从 96 孔收集板转移到含有高日数培养基的 96 孔板中，并在 37 摄氏度下预孵育 15 分钟。然后将激素转移到含有 2 毫升化学成分确定为 BECU 修饰的 Eagles 的 24 孔板中。
中等每孔。将视网膜激素培养物放回培养箱中，并在 37 摄氏度的 5%CO2 气氛、850 微升 PBS 和 50 微升牛零专辑中维持 24 至 48 小时。我的移液管是 2 毫升圆底 eph 管中。
使用 eph 管是圆底的，而不是经典的慢性管，改善了离心过程中细胞的沉淀，从而产生更稳定的细胞调色板。在所需的培养时间后，将视网膜家藝从 24 孔板转移到含有 PBS 和牛 X album Mine 的两毫升 eend off 管中。将含有视网膜家庭藝藓的 eph 管放入在 37 摄氏度、25 微升胶原酶和 25 微升加热的加热块中。
将透明质酸日添加到每个 eph 立方体中，并通过硅化 Poster 移液器以 3 段开始视网膜激素解离成单细胞悬液。加入 10 微升胰蛋白酶，将细胞悬液孵育 3 至 5 分钟。酶解离的潜伏时间各不相同，分别取决于眼睛的大小和发育阶段。
通过轻轻上下吹打来检查组织的酶消化阶段几分钟后，在大约 3 到 5 分钟的另一个孵育期后编辑 10 μL DNA。通过缓慢上下移液，使细胞悬液进一步匀浆。当细胞悬液看起来均匀时，通过添加 10 μL EDTA 来停止组织的消化，并从加热器中取出 eol 管。
向每个 EOL 管中加入 1 毫升新鲜冰冷的 8% Perfomal Hyde，并将细胞悬液在室温下固定在旋转摇床上。固定 1 小时后，将细胞悬液从旋转摇床中取出并放入冷却离心机中。将细胞悬液在 40 摄氏度下离心 5 分钟，并以 0.2 的相对力和力从离心机中取出姑息的细胞悬液。
弃去 SUP natant，将 pate 重悬于 1 毫升中。PBS 每毫升含有 3 毫克 BSA。重复这些洗涤步骤两次后，最后将沉淀重悬于 500 微升中。
PBS 每毫升含 3 毫克。BSA 5 毫摩尔 EDTA 和 0.1% 钠酸，如果随后进行免疫化学染色，请勿向 Resus 悬浮缓冲液中添加钠酸。这会导致染色质量的损失。
磨砂端显微镜载玻片，带有一个或两个孔的胞嘧啶过滤器和插入胞嘧啶夹中的胞嘧啶漏斗行，并且轻微的夹子是闭合的。确保漏斗和胞嘧啶过滤器的孔对齐。所有玻片夹都放入胞嘧啶中心。
Future 转子均质是通过轻轻上下移液获得相关的细胞悬液。将 100 μL Equa 细胞悬液移液至漏斗时，移液管尖端应一直向下延伸到漏斗底部。重要的是不要推过移液管的第二个压力点。
如果这会在细胞点产生气泡，这会妨碍细胞计数，然后将盖子放在转子上，并将转子提升到离心机中。将单细胞悬液以 700 RPM 离心 7 分钟。从胞嘧啶中取出转子并打开盖子。
侧夹打开，漏斗和玻片夹被移除。然后，在幻灯片的背面添加 Sail 点。当过滤器仍在原位时，过滤器被移除，带有帆点的载玻片是盖玻片，并在安装介质中加入 dari。
或者，细胞斑点可以用 BREU 或神经特异性抗体进行免疫化学染色。我们刚刚展示了器官器官型视网膜激素的优势，它提供了一个接近生理体内情况的培养系统，神经元相互作用和连接仍然保留。这种培养系统显着促进了 Morine Eye作的可及性。
就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本视频文章演示了类器官视网膜全层培养的建立以及分析外源性诱导效应的细胞离心程序。这些培养模拟了体内情况，并显著促进了实验操作对小鼠视网膜的可及性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 视网膜生物学
- 实验模型
背景
- 类器官培养为研究视网膜功能提供了更准确的模型。
- 传统的小鼠模型有局限性，可以通过类器官方法克服这些局限性。
- 这些培养允许靶向基因消融和分析。
- 它们增强了视网膜组织的实验可及性和操作。
研究目的
- 建立一种可靠的神经视网膜培养方法。
- 展示用于分析诱导效应的细胞离心程序。
- 提供一个研究视网膜基因功能的平台。
使用的方法
- 类器官视网膜全层培养的建立。
- 用于样本分析的细胞离心程序。
- 对小鼠视网膜的实验操作。
- 靶向基因消融技术。
主要结果
- 成功建立了类器官视网膜培养。
- 有效的细胞离心程序用于分析视网膜样本。
- 展示了相对于传统小鼠模型的优势。
- 促进了实验目的对视网膜组织的访问。
结论
- 类器官视网膜培养是神经科学研究的有价值工具。
- 它们为研究视网膜功能提供了更生理相关的模型。
- 建立的方法可以增强未来的视网膜生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Organotypic murine retinal wholemount cultures enable functional interrogation of retinal gene activity in a physiologically relevant, in vivo-like context, overcoming the limitations of early lethality and malformations in transgenic models. This system preserves neuronal interactions, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for ophthalmic discovery portfolios. The approach facilitates controlled manipulation and quantitative analysis of retinal responses to exogenous factors, enhancing translational continuity from discovery to preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of gene knockdown or overexpression in intact retinal tissue.
- Supports mechanistic de-risking by preserving native cell-cell interactions and neuronal connectivity.
- Facilitates hypothesis-driven evaluation of candidate targets in a disease-relevant system.
- Provides a platform for dissecting pathway-specific effects of recombinant factors or siRNA.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, physiologically relevant retinal systems for downstream compound screening.
- Enables reproducible, quantitative measurement of neuronal apoptosis and cell proliferation.
- Supports assay standardization by maintaining tissue architecture and endogenous signaling.
- Allows for scalable manipulation and analysis of multiple experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant biology by preserving in vivo-like retinal structure and function.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing predictive, quantitative readouts.
- Facilitates biomarker discovery and validation in a controlled yet physiologically relevant context.
Pipeline & Workflow Integration
This organotypic culture method bridges early discovery and preclinical research, enabling robust target validation and mechanistic studies prior to in vivo animal work.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling targeted genetic and pharmacological manipulations in intact retinal tissue.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for evaluating compound effects on neuronal survival and proliferation.
- Analytics: Delivers quantitative outputs such as apoptosis and proliferation rates for comparative analysis across experimental groups.
- Translational Research: Maintains disease-relevant cellular interactions, supporting biomarker alignment and translational continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to various genetic, pharmacological, and developmental studies in retinal research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in retinal target validation.
- Operational Value: Standardizes and streamlines tissue preparation, manipulation, and quantitative analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early de-risking of targets and pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of ophthalmic discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and tissue culture of murine eyes at various developmental stages.
- Needs access to specialized instrumentation for tissue handling, enzymatic dissociation, and cytospin analysis.
- Demands cross-team standardization of dissection, culture, and analytical protocols for reproducibility.
- Adaptation may be necessary for different genetic backgrounds or developmental time points.
- Limitations include technical variability in tissue preparation and potential differences from in vivo pharmacokinetics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:35
Introduction
1:50
Enucleation of Murine Eyes and Dissection of Retinas
11:40
Murine Organotypic Retinal Wholemount Culture
14:10
Dissociation of Cultured Retinal Wholemounts
19:35
Washing of Dissociated Cell Suspensions
24:49
Conclusion
4:02
Dissection of Embryonic, Postnatal and Adult Murine Retinas
