Name: 多电极阵列的犁鼻上皮录音 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-01T16:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学习使用多电极阵列记录小鼠犁鼻上皮神经电活动的方法。该实验通过机械臂精确施加液体刺激，为研究哺乳动物信息素检测和感觉神经生物学提供可靠技术平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Holy实验室的成员。本工作由国家耳聋及其他沟通障碍研究所（R01 DC005964，授予T.E.H.）和美国国家科学基金会IGERT 0548890（H.A.A.）资助。
动物实验是根据美国动物福利法和美国国立卫生研究院指南进行的，并获得了华盛顿大学动物护理和使用委员会的批准。

第1部分. 电生理记录仪器
<ol>
 <li>我们使用一种平面多电极阵列（ALA Scientific Instruments），其电极为10 μm的平面氮化钛电极，以氮化硅绝缘。60个电极被排列成两个区域，每个区域为5×6网格，电极中心间距为30 μm。（也可采用其他配置；直径为10 μm的记录表面电极在分离单个神经元活动方面优于更大的电极。）</li>
 <li>电信号通过MEA 1060放大器（ALA Scientific Instruments）进行放大（放大倍数为1000倍）。信号由数据采集卡（National Instruments）和自定义数据采集软件以10 kHz的频率采集（也可购买商用软件）。</li>
 <li>组织由一块尼龙网（53 μm）固定在MEA上，该尼龙网连接在一个定制的插入件上，该插入件可紧密地嵌入MEA的培养管环内。</li>
</ol>
第二部分. 液体输送仪器
<ol>
 <li>组织需要持续灌流，我们通过高效液相色谱泵（HPLC泵）供给林格氏液（115 mM 氯化钠、5 mM 氯化钾、2 mM 氯化钙、2 mM 氯化镁、25 mM 碳酸氢钠、10 mM HEPES 和 10 mM D-(+)-葡萄糖）来保证这一点。刺激物通过将样品注入HPLC阀并切换流通路径与环路来施加。HPLC泵和注射机器人中的注射泵均使用林格氏液供给。</li>
 <li>实验全程将林格氏液置于恒温水浴（ISOTEMP 105）中，温度维持在42°C，并持续用95% O2 / 5% CO2混合气体鼓泡。另准备一份不含葡萄糖的林格氏液，用于填充注射泵。使用307型HPLC泵（Gilson）以3 mL/min的流速将林格氏液输送至组织。在典型的5至6小时实验中，每种林格氏液各需1 L即足够。</li>
 <li>实验过程中，组织始终以37°C的林格氏液进行持续灌流。加热探头直接置于组织上方。</li>
 <li>刺激物通过Gilson 215液体处理机器人臂递送。刺激物储存于带橡胶盖的玻璃小瓶中，在Gilson软件控制下，机器人臂将刺激物加入灌流管路，同时保持恒定的流速和压力。</li>
 <li>HPLC阀的状态（环路接入/未接入）以电信号电压表示，并由数据采集计算机作为额外通道记录，以确保与神经元活动的同步性。</li>
</ol>
第3部分. 准备MEA和刺激递送装置
<ol>
 <li>进行解剖前，将牛血清白蛋白（BSA）溶于去离子水（dH2O）中，室温孵育MEA孔至少5分钟。</li>
 <li>使用预热并通入气泡的林格氏液冲洗MEA，然后将MEA置于冰上。</li>
 <li>根据制造商说明书对液体处理仪和高效液相色谱（HPLC）泵进行预处理。</li>
</ol>
第4部分. VNO解剖
<ol>
 <li>在进行解剖前，将两皿60×15 mm的培养皿中加入充氧的任氏液，并置于冰上。另取两个相同大小的硅胶包被培养皿，加入任氏液后也置于冰上。额外准备50 mL温热并充氧的任氏液，冷藏备用，用于解剖过程中。 </li>
 <li>小鼠通过 CO2 窒息后颈椎脱位。</li>
 <li>从口角两侧开始，沿下颌线平行向头后部做双侧切口。在颈背部将两切口连接，去除头部背侧部分，保留下颌与小鼠相连。 </li>
 <li>使用精细剪刀，在组织与上颌骨两侧之间进行剪切，以分离组织与骨骼。 </li>
 <li>使用#3镊子剥离腭部组织，以暴露鼻腔。 </li>
 <li>使用小剪刀或手术刀，在上排两颗门牙之间及其两侧进行切割，以将犁鼻器囊从骨头上分离下来。 </li>
 <li>使用#3镊子夹住犁鼻器囊的扁平骨部分，并置于冰上的培养皿中。从开始操作至浸入为止的步骤应在3分钟内完成。 </li>
 <li>将培养皿置于体视显微镜下，使用反射光照明。用#3镊子逐个去除犁鼻器的骨性囊。一手用镊子从尾端固定骨性囊，另一手将骨组织从犁鼻器上剥离，注意避免损伤犁鼻器。 </li>
 <li>当去除骨骼后，将犁鼻器转移至涂有Sylgard的培养皿中。使用另一个培养皿放置另一侧犁鼻器。切换照明至透射光。 </li>
 <li>使用显微剪刀或5号镊子，沿犁鼻器边缘将其与血管分离。此时，神经上皮将完全与血管分离。</li>
 <li>将犁鼻器（VNO）置于内侧（树突侧）朝上的位置。使用#3镊子将VNO的一角固定在Sylgard上。用钳子夹住一小片聚四氟乙烯涂层剃须刀片，以浅角度持刀，从基底膜上剥离神经上皮。&lt; 30° 从培养皿表面剥离）效果最佳。 </li>
 <li>使用玻璃移液管将神经上皮组织从培养皿转移至MEA。将犁鼻器置于电极阵列区域上方，确保树突侧朝上。用移液管吸除多余的林格氏液。将网状组织固定器放入阵列孔中以固定犁鼻器，并加入冷的林格氏液。 </li>
</ol>
第5部分. 记录
<ol>
 <li>将MEA放置在MEA 1060放大器中，并将加热探针置于组织正上方。</li>
 <li>为确认加热探针位置正确，使用含50 mM钾离子（等摩尔替代钠离子）的任氏液刺激组织2秒。调整探针位置，以最小化组织对高钾溶液刺激的神经反应潜伏期。</li>
 <li>在记录前，用预热的任氏液对组织进行45分钟至1小时的灌流，使其充分适应环境。</li>
 <li>使用定制记录软件将电信号保存至磁盘。</li>
</ol>
第6部分. 数据分析
<ol>
 <li>可以使用原始电极记录数据进行离线数据分析。例如，我们测量记录到的细胞在特定配体刺激下放电频率的变化。所得数据集规模较大，可用于回答多种不同的科学问题；因此需要掌握某种编程或数据分析语言（如 C、Matlab、R、Python 或类似语言）。</li>
</ol>
第7部分. 代表性结果
该制备通常足够稳定，可进行长达6小时的记录，产生大量数据（60个电极记录6小时）。 
<img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig1tmb.jpg" alt="神经元活动轨迹、电生理结果、电压波动分析" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 显示了阵列一半区域上同时记录的活动快照。时间窗口跨度为400 ms。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig1.jpg">点击此处</a>查看图1的放大版本。
<img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig2tmb.jpg" alt="电生理数据，雌性小鼠尿液刺激，电压随时间变化曲线，生物反应。" border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 在典型的实验中，我们使用特定感兴趣的化合物进行10秒的刺激。该曲线是响应100倍稀释的雌性小鼠尿液的一个示例。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig2.jpg">点击此处</a>查看图2的放大版本。

<ol><li>Dulac, C., Torelo, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals%3A+from+genes+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li>
<li>Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+Vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Responses of Vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li>
<li>Nodari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfated+steroids+as+natural+ligands+of+mouse+pheromone-sensing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons.</a> J Neurosci. 28, 6407-6418 (2008).</li>
</ol>

多电极阵列记录技术使我们能够同时监测大量神经元群体的活动。该技术是研究感觉系统特性的有力工具，特别是犁鼻器（VNO）。与主嗅觉系统不同，犁鼻器检测的是液相中的刺激物。此外，犁鼻器是一种具有异质性的组织。小鼠犁鼻器中约有300种不同类型的受体1，推测具有不同的反应特征。结合机械臂的多电极阵列记录技术使我们能够可靠地向大量且多样化的神经元群体递送液体刺激，并通过电生理方法鉴定其反应。此外，VNO的稳定性 体外 为同一刺激的多次重复提供时间。 
此前，该技术已被用于研究嗅觉神经元（VSNs）对小鼠尿液刺激的感知特性2，并作为可靠的方法用于鉴定尿液中存在的单个配体3。未来，该技术可能在进一步发现配体以及表征犁鼻器（VNO）的感知特性方面具有重要应用价值。

犁鼻上皮的多电极阵列记录

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

理解神经回路需要能够同时记录多个神经元活动的方法。in vitro研究中，目前可用的一种技术是平面多电极阵列（MEA）记录。本文记录了使用MEA研究小鼠副嗅器官（VNO）的方法，VNO通过表达数百种不同类型受体的多种感觉神经元，在信息素和社会线索的检测中发挥关键作用。将MEA记录与机器人液体处理系统结合以递送化学刺激物，可记录大量且多样化神经元群体的感觉反应。该制备方法使我们能够从小鼠中完整取出VNO的感觉上皮组织，并在数小时内使用一系列化学物质或潜在配体进行刺激，同时监测神经元的电活动。因此，该技术为评估配体活性以及探索受体神经元的特性提供了一种有效的方法。本文介绍了制备副嗅上皮组织、MEA记录及化学刺激所需的技术步骤。

多电极阵列（MEA）记录技术为研究大量神经元群体的电活动提供了一种方法。本文中，我们介绍了在同时刺激组织的条件下，从小鼠副嗅上皮进行记录的多电极阵列制备的详细步骤。

理解神经回路需要能够同时记录多个神经元活动的方法。对于体外研究，目前可用的技术之一是……

使用平面多电极阵列记录UL鼻器官的信号。将小鼠的犁鼻器（VNO）取出，以保持神经上皮的完整性。首先，从小鼠体内取出VNO囊泡。然后从骨性囊中分离出神经上皮，去除血管和基底膜。将组织放置于微电极阵列（MEA）中，树突 knob 侧朝上。一旦完成此设置，我们便使用机械臂向组织施加液体刺激。大家好，我是汉娜·阿农（Hannah Arnon），来自华盛顿大学医学院解剖学与神经生物学系蒂姆·霍利（Tim Wholly）实验室。我是切延·傅（Cheyenne Fu），也来自霍利（Holy）实验室。今天我们将向您展示一种用于犁鼻器多电极阵列记录的实验方法。我们在实验室中采用此方法研究附属嗅觉系统中的感觉特性或受体神经元。现在让我们开始。使用平面多电极阵列（MEA）进行电生理记录，该阵列包含10 µm的平面氮化钛电极，并以氮化硅作为绝缘层。60个电极被排列成两个区域，每个区域由5行6列的网格构成，电极中心间距为30微米。使用MEA 10 60放大器对电信号进行放大，信号需放大1000倍，采样频率为10千赫兹。使用数据采集卡和定制的数据采集软件，通过尼龙网将组织固定在微电极阵列（MEA）上，该尼龙网连接至一个特制的插入件，该插入件可紧密地置于培养皿内。在了解了MEA的使用之后，接下来让我们学习如何进行犁鼻器（VNO）解剖。在开始解剖之前，先用牛血清白蛋白（BSA）填充MEA孔，随后用温热的充氧林格溶液冲洗MEA，并将其置于冰上。为解剖做准备，将两个60 mm × 15 mm的培养皿中装入通入气泡的任氏液，并置于冰上。同时，将另外两个相同大小的硅胶涂层培养皿中加入任氏液，也置于冰上。另准备50 mL冰冷的通气任氏液，用于解剖过程中使用。取一只已处死的小鼠，从口角两侧开始，沿下颌骨平行向头后部做双侧切口。在颈背部将两侧切口连接，用精细剪刀去除头部背侧部分，保留下颌骨与小鼠相连。在上颌骨两侧的组织与骨之间进行剪切，使组织与骨分离。接下来，使用3号镊子剥离腭部组织，用小剪刀或解剖刀在上颌两颗门齿之间及两侧进行切割，暴露鼻腔，并用3号镊子将脆弱的鼻甲软骨从骨头上分离下来。用镊子夹住鼻甲软骨的扁平骨部分，将其放入盛有冰的培养皿中。从开始操作至将犁鼻器浸入冷的林格液，整个过程应在三分钟内完成。为防止组织坏死，将培养皿置于反射光照明的体视显微镜下。使用3号镊子一次去除一个犁鼻器的骨性囊。用一只手从囊的尾端夹住以固定骨性囊，另一只手将骨组织从犁鼻器上剥离，注意避免损伤犁鼻器。去除骨骼后，将v和o转移至涂有雪茄的培养皿中。用剩余的培养皿处理另一个VNO。切换照明方式，使用透射光，并配合显微剪刀操作。或使用5号镊子。沿VNO边缘剪开，将其与血管分离。此时，神经上皮将完全与血管分离。使用3号镊子将VNO放置于内侧朝上的位置。用钳子夹住一小段聚四氟乙烯涂层剃刀碎片，将VO锚定在组织一角的S型护罩上。以小于30度的浅角度持刀，从培养皿表面开始，将神经上皮从基底膜上剥离。效果最佳。使用玻璃移液管将神经上皮组织从培养皿转移至MEA，将犁鼻器置于电极阵列上方，树突侧朝上。用移液管去除多余的林格溶液，然后将网状组织固定器放入阵列的孔中，以固定犁鼻器组织。解剖完成后，向孔中加入冰冷的林格溶液。让我们来看如何开始记录。要开始记录，将MEA芯片放入MEA 10 60放大器中，并将加热探头置于组织正上方，以确认加热器位置正确。将探针放置于含50毫摩尔氯化钾的任氏液中刺激两秒。调整探针位置，以最小化神经组织对氯化钾溶液刺激的反应潜伏期。组织需持续灌流，可通过高效液相色谱泵供给任氏液实现。记录前使用加热的林格溶液对组织进行45分钟至1小时的超级灌流，以使组织适应环境。刺激物通过Gilson Two 15液体处理机器人手臂递送。通过将液体注入HPLC阀并切换流通状态与环路，在Gilson软件控制下，机器人手臂将刺激物注入灌流管路，同时保持恒定的流速和压力。高效液相色谱阀的状态由一个电压信号表示，该信号被采集计算机记录为额外通道。为确保与神经元活动同步，电信号使用自定义记录软件保存至磁盘。接下来，我们将向您展示一些犁鼻器多电极阵列记录的代表性结果。由于电极数量众多，该实验能产生大量数据，且制备样本通常可保持约六小时的稳定性。以下是来自MEA一半区域的400毫秒数据示例。该方法可用于测量感觉神经元对配体的反应，图中显示的是单个电极记录到的经100倍稀释的雌性小鼠尿液所引发的反应。尿液释放持续了10秒，如黑色条所示。注意，刺激呈现后神经元放电活动的增加。我们刚刚向您展示了在执行此操作时如何对小鼠犁鼻器进行多电极阵列记录。需要牢记的是要保持耐心。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

multielectrode-array-recordings-of-the-vomeronasal-epithelium

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

多电极阵列的犁鼻上皮录音

电嗅图（EOG）记录是一种在嗅觉上皮水平评估嗅觉功能的可靠、易于实施且信息丰富的检测方法。本方案描述了记录装置的搭建、小鼠组织样本的制备、数据采集以及基本的数据分析方法。...

利用气相电嗅觉图记录分析小鼠嗅觉感觉神经元的反应

研究神经元雪崩（即具有时空尺度不变性的活动爆发）的一种可靠方法，可反映大脑皮层中临界状态动力学特征。在培养的皮层浅层发育过程中，雪崩会自发出现，从而可在精确控制的条件下，利用平面集成多电极阵列（MEA）对神经活动进行长期测量。...

器官型培养中神经元雪崩的多电极阵列记录

犁鼻器（VNO）可检测种内化学信号，这些信号传递社会和生殖信息。我们利用在犁鼻器组织中表达G-CaMP2的转基因小鼠进行了Ca2+成像实验。该方法使我们能够分析犁鼻神经元对大量信息素刺激所产生的复杂反应模式。...

在表达基因编码钙传感器的犁鼻器组织切片中成像神经元反应

本视频演示了使用穿孔膜片钳技术对小鼠嗅觉感觉神经元（OSNs）进行电生理记录的方法。从小鼠中分离出含有表达荧光标记气味受体的OSNs的嗅觉上皮组织，并将其固定在记录室中。将记录电极夹持在OSN的树突 knob...

小鼠嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录

该实验方案视频介绍了在小鼠犁鼻器（VNO）感觉神经元上建立全细胞膜片钳技术以进行电生理记录的方法。将带有荧光标记感觉神经元的冠状VNO脑片置于记录装置中，用记录电极对其中一个标记的神经元进行全细胞模式膜片钳，以记录其对化学刺激产生的电生理反应。...

建立用于犁鼻感觉神经元电生理记录的全细胞膜片钳技术

在蜜蜂中建立了同时对两个不同脑神经簇或两个不同解剖通路进行的细胞外长期记录。这些记录使得能够在活体动物中，在单个神经元水平以及神经元集群水平上，研究不同脑区之间神经活动处理的时间特性。...

在行为蜜蜂中同时进行两个神经处理阶段的长期记录

小鼠副嗅球（AOB）在感觉编码研究中一直难以进行深入探索。本文展示了一种解剖方法，可制备出一种离体（ex...

离体 完整犁鼻器及副嗅球的制备

本文详细介绍了如何对人类癫痫皮层组织进行多电极阵列记录。具体演示了癫痫组织切除、脑片制备以及间歇期和发作期事件的多电极阵列记录过程。...

人脑癫痫术后皮层组织的多电极阵列记录

分析嗅觉感觉神经元的生理特性仍面临技术上的局限。本文通过在基因靶向小鼠的完整嗅觉上皮组织制备中采用穿孔式膜片钳技术记录这些神经元的活动。该技术可用于表征表达特定嗅觉受体的神经元的膜特性及其对特异性配体的反应。...

完整上皮组织中嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录：表达特定嗅觉受体神经元的功能分析

本文介绍了一种生理学方法，该方法利用全细胞膜片钳记录技术，在小鼠犁鼻器急性冠状组织切片中对特定感觉神经元群体进行鉴定和深入分析。...

小鼠犁鼻器急性组织切片中特定细胞群体的深入生理学分析

本研究介绍了一种同步记录自由活动大鼠脑部局部场电位、心电图、肌电图和呼吸信号的方法。该技术可降低实验成本并简化数据分析，有助于深入理解大脑与外周器官之间的相互作用。...

自由活动大鼠皮层局部场电位、心电图、肌电图与呼吸节律的同步记录

学习使用多电极阵列记录小鼠犁鼻上皮神经电活动的方法。该实验通过机械臂精确施加液体刺激，为研究哺乳动物信息素检测和感觉神经生物学提供可靠技术平台。

犁鼻上皮的多电极阵列记录

探索更多视频