审核端粒G -悬结构锥虫布氏

以下实验的总体目标是检测端粒G链突出结构。在布氏锥虫细胞中，采用原位凝胶杂交技术，在天然条件下利用序列特异性的寡核苷酸探针与端粒的单链区域进行杂交。

该单链区域为端粒G端突出区域，因此杂交的寡核苷酸探针的量代表其长度适配器。当使用标记的特异性寡核苷酸时，连接反应可确定端粒G端突出末端的序列。该方法涉及将序列特异性的适配器连接至端粒G端突出结构的末端，用于连接介导的初级延伸检测。

引导寡核苷酸在连接至染色体末端之前，需进行末端标记，并与独特的寡核苷酸互补。连接后，使用T4 DNA聚合酶进行初次延伸。随后可通过产物长度确定G端突出的长度，该产物比实际的G端突出长n减去6个核苷酸，其中n代表适配体中引导寡核苷酸的长度。

您好，我是比博，克利夫兰州立大学生物、地质与环境科学系的助理教授。嗨，我是乔，我是李博士实验室的研究生，今天我们将向您展示一种分析地质岩心结构的实验方法。

我们在使用放射性物质研究Trapasso中的端粒结构和功能时采用此实验步骤。由于本实验涉及放射性操作，必须采取适当的安全防护措施。在开展实验前，应咨询所在机构的环境健康与安全部门。

本视频中，出于演示目的，省略了部分前体物质。现在我们开始。该步骤的原理是在天然条件下，一个未标记的tell C探针包含四个C-C-C-T-A重复序列。

一段寡核苷酸只能与单链的端粒G端悬垂区域杂交，因此杂交信号强度与悬垂长度成正比。经过变性和中和处理后，同一探针能够与整个端粒区域杂交。

这种杂交信号的强度代表了端粒DNA的总量，并用作上样对照。最终的G端悬突水平可通过将天然状态下的杂交信号除以变性后的杂交信号来计算。该实验流程首先通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）分离完整的染色体，这要求基因组DNA被制备在琼脂糖小块中，以避免DNA发生机械剪切。为实现此目的，首先将低熔点琼脂糖（LMP琼脂糖）在L缓冲液中溶解至1.6%浓度，并在50摄氏度下保温；随后通过离心收集2亿个T. brucei细胞。

去除上清液，并用 L 缓冲液重悬细胞沉淀，使细胞终浓度为每毫升 500 万个细胞。将细胞悬液在 42 至 50 摄氏度下孵育 10 分钟。然后将一体积的 1.6% LMP 与一体积的细胞混合，迅速充分混匀，并将 85 微升细胞悬液快速分装至一次性插件模具的每个孔中。

待胶块凝固后，将其转移至含有5毫升L缓冲液和1% sarcosyl细胞的15毫升锥形管中。加入少量蛋白酶K粉末，充分混匀，并在50摄氏度下孵育48小时。

孵育结束后，弃去缓冲液，用5毫升L缓冲液将胶块洗涤两次。然后在L缓冲液中加入蛋白酶K，于SAR caol条件下再次消化48小时。用新鲜的L缓冲液再次洗涤胶块，并将其保存在4°C的L缓冲液中。

这些胶块应在两周内使用。按照书面实验方案所述，用含有DNA胶块的琼脂糖凝胶进行制备。接着，在CHEF DR II型电泳仪中进行电泳。

脉冲场凝胶电泳（PFGE）结束后，将凝胶染色、拍照并干燥。待凝胶完全干燥后，将其放入杂交袋中，并加入20毫升预杂交缓冲液。尽可能排出袋中空气，然后密封杂交袋。

将杂交袋置于50摄氏度的水浴中，轻轻摇动孵育至少一小时，同时对凝胶标签进行预杂交。将寡核苷酸探针在37摄氏度下孵育反应一小时。然后向反应混合物中加入90微升TNES缓冲液。

为纯化标记的探针，将探针加样至预装的G 25柱顶部。用700微升TNAS缓冲液洗涤，并在600微升洗脱液中洗脱探针。在凝胶预杂交后，将标记的探针煮沸5分钟，然后加入25毫升新鲜的预杂交缓冲液中。

配制杂交缓冲液时，从滤袋中取出预杂交缓冲液。使用0.22微米注射式滤器对杂交混合液进行无菌过滤，并直接加入杂交袋中。密封杂交袋，放入盛有温水的浅容器中。

将整个容器放入50摄氏度的水浴中，在轻轻摇动的条件下孵育过夜。第二天，在杂交袋上剪开一个小口，插入50毫升的锥形管，尽可能倒出杂交混合液。

将探针在负20摄氏度下保持冷冻。从杂交袋中取出凝胶，并将其放入容器中，按照书面实验方案所述清洗并干燥凝胶。干燥后，用塑料膜包裹凝胶，并将其暴露于磷屏成像仪中约三天。

三天后，扫描磷屏成像仪，以在变性后进行杂交。首先将凝胶在室温下置于变性缓冲液中孵育30分钟，然后用中和缓冲液洗涤凝胶30分钟。

接着，用蒸馏水冲洗凝胶3分钟。在55°C下预杂交凝胶1小时。使用含有相同探针的杂交混合液进行杂交，条件同前，但在杂交后于55°C下过夜孵育。

按照之前的方法洗涤并干燥凝胶。然后将凝胶包裹后置于磷屏成像仪中曝光约两小时。扫描磷屏成像仪，最后将变性前获得的杂交信号与变性后获得的杂交信号进行归一化处理。

在此步骤中，通过接头连接确定T末端核苷酸。将独特的寡核苷酸末端标记后与引导寡核苷酸连接，并连接至端粒末端。只有当独特的引导接头具有与末端端粒序列相容的3'突出端时，接头才会被连接。

对于布氏锥虫（T. brucei），端粒可能以TTAGGG重复序列的六种不同核苷酸之一结尾。因此，该过程需使用六种不同的引导寡核苷酸启动。

将6微升浓度为10摩尔/微升的特异性寡核苷酸与3微升10倍PNK缓冲液、5微升γ-P³² ATP、14微升双蒸水以及2微升T4 PNK混合，用激酶处理该特异性寡核苷酸。在37摄氏度下孵育反应体系1小时。随后，使用Kayak快速核苷酸去除试剂盒去除未掺入的放射性ATP并进行洗脱。

将末端标记的寡核苷酸加入60微升洗脱缓冲液中。为获得约1 pmol/微升的终浓度以构建连接子，需将独特的寡核苷酸与引导寡核苷酸进行退火。向2微升每种引导寡核苷酸中加入10微升纯化的独特寡核苷酸和1微升退火缓冲液。

将试管放入85摄氏度的加热模块中，随后关闭加热模块。让试管和加热模块静置数小时，冷却至室温。然后将接头连接至总基因组DNA。

将混合物在PCR仪中于16摄氏度孵育过夜。孵育过夜后，按照书面实验方案进行限制性内切酶消化。向每个样品中加入3微升10倍浓度的橙G染料。

将DNA样品上样至一块20厘米×20厘米的0.7%琼脂糖凝胶中。以30伏电压电泳30分钟，随后提高电压继续电泳，保持电压低于120伏，使一小时内总电压达到1000伏。

凝胶电泳结束后，使用Typhoon扫描仪扫描AUM溴化物染色凝胶。最后将琼脂糖凝胶干燥，并将干燥后的凝胶在磷屏成像仪中曝光过夜。在连接介导的引物延伸实验中，引导寡核苷酸首先进行末端标记，然后与唯一的寡核苷酸退火，再特异性地连接至染色体末端。

将连接带有与G突出端相容的3'突出端的独特引物接头。在去除未连接的寡核苷酸对后，可使用缺乏链置换活性和5'至3'内切酶活性的T4 DNA聚合酶进行初次延伸。因此，延伸后引物寡核苷酸的最终长度反映了G突出端的长度。

开始连接介导的引物延伸激酶反应时，将唯一的寡核苷酸和引导寡核苷酸分别在37摄氏度下孵育60分钟。通过在一个1.5毫升离心管中混合10微升磷酸化的唯一寡核苷酸和10微升末端标记的引导寡核苷酸，使引导寡核苷酸与唯一寡核苷酸退火，退火后连接该退火引物-唯一寡核苷酸接头至端粒末端，具体步骤如前所述。随后沉淀DNA，并按照书面方案进行初次延伸反应。

制备一块含10%丙烯酰胺、7摩尔尿素、1倍TPE的凝胶，用于电泳分离延伸产物。将每份预变性并加入染料的样品各取4微升上样至凝胶中。在1倍TBE缓冲液中以800伏电压电泳，直至蓝色染料迁移至凝胶底部。

随后将凝胶从玻璃板上取下。将凝胶干燥器设置为65摄氏度，保持30分钟，并在凝胶干燥器恢复至室温后继续干燥30分钟，最后将凝胶暴露于磷屏成像仪中两小时。图中显示了通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）分离的完整tbrc染色体。

布氏锥虫细胞通常含有约100条微小染色体，大小相似，在凝胶电泳中迁移至相同位置。由于这一特性，使用TC寡核苷酸探针杂交后，端粒G端悬突信号在微小染色体上最为明显。经变性与中和后，使用TLC寡核苷酸探针杂交可显示所有染色体末端的端粒信号。

使用TLG寡核苷酸探针进行杂交通常不会产生任何杂交信号，因为布氏锥虫细胞不具有端粒C链悬垂结构。经过变性及中和后，使用Tel G寡核苷酸探针杂交也能在所有染色体末端显示出端粒信号。在适配子连接实验中，每泳道上样等量的DNA对于确定端粒末端核苷酸至关重要；本方案中通过溴化乙锭对凝胶染色来验证上样量的一致性。末端标记的独特寡核苷酸适配子和引导寡核苷酸适配子仅能连接到具有与引导寡核苷酸序列相容的端粒G链悬垂序列的染色体末端。

由于独特的寡核苷酸在末端标记，连接产物将具有放射性并产生强信号。第一泳道显示强信号，表明大量独特的TG1接头已连接至端粒末端。TG1的末端序列为C-C-C-T-A，因此连接到该接头的端粒G链突出端为TT A GGG。

使用其他引物寡核苷酸时未观察到显著的连接产物，表明布氏锥虫细胞中以TTAGGG结尾的端粒占主导地位。加载末端标记的引物寡核苷酸作为无连接反应的阴性对照和大小标记。末端标记的引物寡核苷酸长度为22个核苷酸。

约44个核苷酸处的条带很可能是连接至染色体末端后残留的未变性接头。延伸产物的大小反映了G端突出结构的长度。大多数布氏锥虫端粒G端突出以TT A GGG结尾。

然而，这些 G 突出端的长度非常短，约为 10 个核苷酸。由连接后的 TG one 引物寡核苷酸延伸出的产物长度与引物寡核苷酸本身相比并无明显增加，尽管仅有少量 TG four 衔接子连接到端粒末端，但从连接后的 TG four 延伸出的产物则明显更长，其中最长的产物约为 55 个核苷酸。因此，在 tbrc 细胞中观察到了两种类型的端粒 G 突出端结构。

如果连接产物确实源于端粒G链突出结构，那么用对3'端突出具有特异性的核酸酶XO或XOT处理基因组DNA，应会导致连接产物的消失。两种类型的G链突出结构对此类处理均敏感。我们刚刚向您展示了如何在trapasso bru中分析端粒giang结构。

进行此操作时，重要的是要记住在每个泳道中加入等量的样品。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。