在哺乳动物细胞中的DNA双链断裂（DSB）的维修分析

本文介绍了基于GFP的荧光

该视频方案中演示了一种在哺乳动物细胞系中通过 NHEJ 或 HR 测量 DNA 双链制动修复的效率和准确性的方法。该程序首先生成包含染色体整合的 NHEJ 或 HR 报告基因盒的单拷贝的细胞系。然后用 I SCE、一种表达质粒和 DS red 的混合物以及一种质粒转染这些报告细胞。

我 sce.一种核酸内切酶在报告基因构建体中产生双链断裂，DS RED 用作转染对照。然后通过传真分析 GFP 阳性和 DS 红细胞的百分比，以便在需要时量化 NHEJ 或 HR 的效率。

通过挽救大肠杆菌中的报告产物并对修复产物进行排序来分析修复的保真度。通过这种方式，基于修复事件的流式细胞术定量和修复产物的测序来确定给定细胞系中双联链断裂或 DSB 修复的效率和保真度。与现有的双弦制动器修复分析方法相比，该方法具有许多优点。

首先，这种方法专门区分了同源重组和非同源和连接。然后该方法高度定量，允许通过流式细胞术分析数百万个细胞，然后该方法在修复完成后不需要大量包装细胞以选择抗生素耐药性 cl。最后，可以通过查看绿色细胞的外观来实时监控修复的完成情况。

这种方法可以帮助回答修复领域的关键问题，例如测量病毒突变细胞类型或药物治疗后的 HR 和 HEGA 修复效率。检查细胞周期不同阶段的 A 修复并测量修复率 所以一般。通常，刚接触这种方法的个体会遇到困难，因为获得良好的转染效率很重要。

在这个过程中。两个报告基因盒用于检测双链 DNA 断裂的修复。一个包埋盒用于检查非同源末端连接或 N-H-E-J-D-N-A 修复。

另一种用于观察同源重组或 HR DNA 修复非同源末端。连接报告基因盒包含一个 GFP 基因，该基因具有来自 PEM 1 基因或 GFP PEM 1 的工程化 3 千碱基内含子。简而言之，P 1 介绍包含一个腺病毒外显子，两侧是印地语 3 和 I SCE 1 核酸内切酶的识别序列，用于诱导双链断裂。

I SCE one 位点是反向 I SCE one 具有非回文识别序列，因此两个反向位点产生不兼容。DNA 末端不相容。DNA 末端最能模拟天然存在的 dss。

未排列的 NAEJ 盒为 GFP 阴性，因为腺病毒外显子破坏了 G-F-P-O-R-F。在 ISEE one 诱导双链 DNA 断裂后，腺病毒外显子被去除，NHEJ 恢复 GFP 基因的功能。同源重组报告基因盒也基于 HR 盒中的 GFP PEM one 构建体。

G FP PEM 的第一个外显子包含一个 22 个碱基对的缺失，并插入了 3 个限制性位点。I SCE 一 印地语 三 I SCE E 一。删除可确保 GFP 也不能在此处由 NHEJ 事件重组。

I SCE one 站点处于倒置方向。所以 I SCE 一消化留下了不兼容的末端。GFP PMM 1 的第一个拷贝之后是一个启动子，减去 TG，减去 GFP M1 的第一个外显子和 t 介绍。完整构建体在 I sce E one 消化诱导双链断裂时为 GFP 阴性。

功能性 GFP 基因由第一个 GFP PMM 的两个突变拷贝之间的基因转换事件、一个外显子、其他类型的 DSB 修复（例如交叉单链跪着）重建。并且 NHEJ 不会重建 GFP 基因。由于缺少 GFP 基因的第二个拷贝。

第一个 A TG 密码子和第二个外显子通过交叉或单链跪下解析并不能恢复 GFP 活性。因此，这种设计允许通过基因转化专门检测分辨率，这是哺乳动物细胞中的主要 HR 通路。要开始此程序，请使用 Kyogen 的 endo free 试剂盒制备高质量的 NHEJ 或 HR 报告基因质粒储备液，将 10 μg 质粒线性化，并从消化液中纯化 DNA。

有关质粒制备的详细信息，请查阅随附的书面方案。为转染做准备。确保正常的人成纤维细胞保持在最佳生长条件下。

如果从冷冻样品瓶开始，请在转染前将细胞分液两次。如果从一板汇合细胞开始，细胞分裂一次，细胞就会生长到 70% 至 80% 汇合。这大约需要两天时间，将 5 乘以 10 到第五个细胞接种在 100 毫米板中。

为获得最佳转染效率，应使细胞对数生长。活跃生长的培养物包含处于 M 期的细胞，显示为附着在表面的圆形细胞，用于转染，从两个 100 毫米板中收获大约 6 个细胞的 10 倍 2 倍。关键是不要用过胰蛋白酶：一旦 80% 的细胞从板中分离，细胞就会停止胰蛋白酶。

将细胞重新悬浮在 NHDF 溶液中。由于细胞对 NHDF 溶液敏感，因此请尽量减少孵育时间并轻轻混合细胞。接下来，使用 amaxa 核效应子用 0.5 μg 线性化报告基因构建体转染正常人成纤维细胞的细胞。

这些转染条件导致转染后 24 小时以 1 毫克/毫升遗传或 G 4 18 的浓度整合大部分积分的单个报告基因构建体拷贝。为了选择具有染色体整合报告基因构建体的细胞，请继续选择 7 到 10 天，然后挑选单个 G 4 1 8 抗性菌落或合并抗性克隆。将培养物扩展到大约五个 100 毫米的板。

冷冻三个板以备将来使用，并将剩余的两个板扩展到每 100 毫米板 10 到第五个细胞的 5 倍。10 个 100 毫米板通常足以进行 5 次转染。铺板后 2 天，当含有报告基因构建体的细胞达到 70% 至 80% 时，与 5 μg I sce、1 μg 表达质粒和 0.1 μg DS 红色质粒的混合物汇合。

作为转染效率对照，使用 AM maxon 核效应器转染对数生长培养物中 6 个细胞的 2 倍 10 左右。由于 DSP 效率是以 GFP 阳性细胞与 DS 红细胞的比率来测量的，因此 ISCE one 和 DS 红质粒混合物的变化可能会影响结果。质粒质量也可能通过改变转染效率来影响结果。

因此，为了获得一致的测量结果，重要的是在一个实验中使用相同的质粒混合物同时，为每个对照准备三个校准对照的事实。转染 6 个细胞中 10 个细胞的 2 倍左右。这三个对照是 5 μg 表达 EGFP 的质粒、5 μg DS、红色质粒和 5 μg。

不表达荧光蛋白的对照质粒。转染后 3 天，通过带有滤光片的荧光倒置显微镜验证 GFP 和 DS 红蛋白的转染和表达效率，以检测 GFP 和 DS。红色细胞在传真分析前再生长一天，转染后 4 天收获 I SCE one 转染的细胞和对照细胞。在这个阶段，收获所有细胞并获得圆形细胞至关重要。

为此，请使用更长的胰蛋白酶化时间或更高浓度的胰蛋白酶。在显微镜下检查细胞，确认 99% 的细胞从板中分离并呈圆形。将细胞重新悬浮在 500 微升 PBS 中并转移到传真管中。

将细胞放在冰上并避光保存，同时可以将细胞在冰上储存几个小时。为获得最佳结果，请在收获后立即分析细胞。接下来，使用 TFP DS RED 和阴性对照校准事实。

调整电压和颜色补偿，以便将所有荧光细胞包括在分析中。请记住，实验样品的荧光强度低于对照的荧光强度。用对照校准事实后，分析 I SCE one 转染细胞，每次处理至少计数 20， 000 个细胞，以防止 GFP 和 ds 之间的潜在干扰。

红色荧光使 GFP 阳性或 DS red 阳性细胞的百分比保持在 25% 以下，如果百分比较高，则减少 DS RED 或 I sce E 一个质粒的量。GFP 阳性细胞的百分比对应于 D-N-A-D-S-P 修复的效率，DS 红色阳性细胞的百分比表示转染的效率。计算 D-N-A-D-S-P 修复的相对效率，作为 GFP 阳性细胞与 DS 红阳性细胞的比率。

为了确定修复禁令的准确性，通过用 eco R one 酶环化消化基因组 DNA 并转化为感受态大肠杆菌细胞来挽救报告基因构建体。这种拯救是可能的，因为原始构建体包含通过限制性、消化和测序分析的细菌复制起点。这些是典型的事实，对照横断面以及 NHEJ 和 HR 实验的结果。

与对照相比，I SCE one 转染细胞的荧光强度和荧光细胞数量较低。荧光信号的差异是由于这些细胞中 GFP 和 DS RED 构建体的拷贝数不同。实验中的每个细胞都包含一个整合的报告基因构建体拷贝。

因此，成功的修复事件在一小部分细胞中重建 GFP 基因。NHEJ 和 HR 的效率计算为 GFP 阳性与 DS 红细胞的比率。在人类细胞中，NHEA 是一种比 HR 更有效的过程，在人类成纤维细胞中，NHEJ 效率通常为 0.6 至 1.3，HR 效率为 0.05 至 0.3。

这项技术为 DNA 修复领域的研究人员探索各种因素在 HEG 和 HR 中的作用以及研究哺乳动物细胞中 NHEG 和 HR 的动力学和调节铺平了道路。观看本视频后，您应该对如何使用荧光检测法测量哺乳动物细胞中 HR 和 GJ 的效率和准确性有了很好的了解。