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从肺组织生成单细胞悬液以鉴定稀有抗原特异性 T 细胞群

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JoVE 杂志免疫与感染

Generating Single-Cell Suspension from Lung Tissue for Identifying Rare Antigen-Specific T-Cell Populations

从肺组织生成单细胞悬液以鉴定稀有抗原特异性 T 细胞群

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03:21 min

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July 19, 2024

DOI:

10.3791/201919-v

DOI:

10.3791/201919-v

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03:21 min

July 19, 2024

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Daniel S. Shin^1,2,3, Juliana Barreto de Albuquerque^1,3, James J. Moon^1,3,4

¹Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology,Massachusetts General Hospital, ²Division of Immunology,Boston Children’s Hospital, ³Harvard Medical School, ⁴Division of Pulmonary and Critical Care Medicine,Massachusetts General Hospital

成績單

将 1 至 3 毫克荧光团偶联的抗小鼠 CD45 抗体在 100 毫升生理盐水中稀释，静脉注射到每只麻醉小鼠中。首先将每只小鼠的专用组织解离管中制备的 4 毫升冰冷的 HEPES 缓冲液置于冰上。对小鼠实施安乐死后，将切除的肺放入各自的组织解离管中，在冰上冷却。

将试管放在自动组织分离器上，并运行肺组织的第一个预设程序。然后，向含有解离肺组织的每根试管中加入 500 μL liberase 储备溶液和 500 μL 氨基胍储备溶液。在章动搅拌机上以 30 摄氏度孵育 37 分钟。

之后，将试管放回分离器上，并为肺组织运行第二个预设程序。现在将单细胞悬液从组织解离管中通过 100 微米的细胞过滤器倒入 50 毫升锥形管中。用 5 毫升完全 EHAA 冲洗组织解离管，然后通过过滤器进入 50 毫升管中。

取下过滤器后，将细胞悬液的体积增加到 50 毫升，并加入完全 EHAA。不要使用专门的组织解离管，而是将切除的肺放入各自的 1.5 毫升微量离心管中，并在冰上冷却。收集完所有肺后，将每个肺转移到不含任何细胞培养基的新鲜微量离心管中。

用剪刀在微量离心管内将肺切成小碎片。向每个试管中加入 1 毫升 liberase TM 和 DNase I 消化混合物。在 37 摄氏度的水浴中孵育 30 分钟。

然后，将样品倒入放置在 50 mL 锥形管顶部的 100 μm 样品池过滤器上。将剩余样品移出到过滤器上。用无菌 1 毫升注射器的柱塞橡胶端将组织捣碎在网眼上。

用冷分选缓冲液冲洗过滤器，在试管中收集最终体积为 7 mL。无论使用自动或手动解离方法，离心所得细胞悬液。小心吸出上清液，留下大约 100 微升的上清液和细胞沉淀。

最后，加入大约 100 微升的 Fc 块溶液，使总体积达到 200 微升，并剧烈涡旋以重悬沉淀。

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Single-cell Suspension Antigen-specific T-cell Populations CD45 Antibody Liberase Stock Solution Aminoguanidine Stock Solution EHAA Microfuge Tubes DNase I Digestion Centrifuge Fc Block Solution

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