细胞骨架与黏着斑组织检测：一种基于免疫荧光的细胞在基质上黏附与铺展研究方法

— 底物形态对外癌细胞的行为和转移反应具有显著影响。由肌动蛋白细胞骨架构成的动态网络为细胞提供结构支持，并介导细胞运动。一类称为黏着斑的大型膜相关蛋白复合物将细胞骨架与细胞外基质相连，促进细胞铺展。

开始染色时，取一培养的癌细胞，用多聚甲醛处理以固定和通透细胞。随后，将细胞与含有蛋白质的信号增强试剂孵育，以降低背景染色。加入抗万古霉素（vinculin）一抗，该抗体可结合黏着斑复合体中的万古霉素蛋白。

接下来，将样本与荧光染料标记的二抗孵育，该二抗靶向一抗。最后，用荧光标记的鬼笔环肽偶联物处理细胞，该偶联物可选择性结合细胞骨架中的肌动蛋白纤维。在共聚焦激光扫描显微镜下观察细胞，以研究其荧光信号。

形态充分伸展的细胞具有清晰的肌动蛋白纤维，并呈现出明显且拉长的含纽蛋白（vinculin）的黏着斑。相反，伸展不良的细胞缺乏清晰的肌动蛋白丝状结构，仅表现出点状的含纽蛋白黏着斑。在以下实验方案中，我们将演示一种免疫荧光检测方法，用于研究原代结肠癌细胞中细胞骨架及黏着斑的组织结构。

— 将待进行免疫染色的基质转移至超净工作台，移除培养基。随后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗基质，并在室温下用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞20分钟。用PBS洗涤基质，每次5分钟，共洗涤三次。然后加入500 µL信号增强剂，孵育30分钟，再用PBS冲洗。

接下来，在室温下用 PBS 1:250 稀释的单克隆抗粘连蛋白抗体孵育细胞 45 分钟。然后用 PBS 洗涤基质，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。将样品在室温下用 PBS 1:200 稀释的 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG 二抗孵育 30 分钟。然后再次用 PBS 洗涤基质，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。

为了观察F-肌动蛋白结构，在室温下用结合了四甲基罗丹明的鬼笔环肽（tetramethylrhodamine-phalloidin conjugates）以每毫升50微升的浓度孵育细胞45分钟。然后，再次按之前的方法洗涤基底。最后，使用共聚焦激光扫描显微镜对样品进行成像。