无标签原位成像在植物细胞壁的木质化
November 1st, 2010
基于共焦显微拉曼光谱方法是给予无标签的可视化在植物细胞壁的木质素和木质化比较在不同的组织，样品或物种。
该程序的总体目标是直接成像和比较植物细胞壁中的木质化，其空间分辨率具有亚微米级，而不会对接近天然状态的样品进行染色或标记。这是通过首先通过微音从天然组织中切下薄片来实现的。下一步是在共聚焦拉曼显微镜中获取样品感兴趣区域的光谱图。
这是通过 Rasta 扫描样品并记录每个样品位置的拉面光谱来实现的。最后一步是分析光谱数据集并计算化学图像，其中木质素的空间分布通过积分特定拉面带的强度来可视化，这些拉面带可归因于木质素的分子振动。最终，可以获得显示木质素空间分布的结果，而无需对样品进行染色或标记。
通过共聚焦 rama 显微镜，可以比较不同测量值、组织、样品和物种之间的木质素信号强度。大家好，我是劳伦斯伯克利国家实验室分子铸造厂的科学家 Jim Shock。大家好，我是来自加州大学伯克利分校能源生物科学研究所的 Martin Schmidt。
今天，我们将向您展示植物细胞壁中木质化的无标记成像程序。那么让我们开始吧。要开始此过程，请将植物样品（如杨树茎木或拟南芥 ANA 茎）放入这里的切片机中，准备拟南芥 ANA 茎切片。
然后从天然组织中切下薄片，通常为 20 微米厚。为获得最佳结果，样品完成后应进行水合。切割，将每个植物部分转移到玻璃显微镜载玻片上。
最后，将植物切片浸泡在额定水或带有玻璃盖的 D 二 O 盖上，滑入并密封到显微镜载玻片上，以防止 D 二 OD 二 O 蒸发，它不是样品的天然物质，可用于进行强度归一化。植物切片现在可以进行成像，也可以存储以备将来使用。在对样品进行分段之前，将浸油涂抹在显微镜物镜和盖玻片处，并将显微镜载玻片固定在显微镜的压电扫描台上，盖玻片面向显微镜物镜，使用高数值孔径浸没显微镜物镜，通过盖玻片观察样品并找到感兴趣的样品区域。
接下来，关闭所有其他实验室和显微镜光源。通过将来自 CW 激光器的带通过滤的单色绿光聚焦到样品上，进行位置分辨微光谱测量。在典型功率为 10 至 30 毫瓦的情况下，某些样品中可能会出现自发荧光，这可能会妨碍有用的测量。
如果是这种情况，请尝试使用较长波长的激光激发。后面分散的斯托克发生了变化。拉面光由显微镜收集。
物镜通过二向色镜、针孔（在共聚焦装置中用作空间滤光片）和长通滤光片。光聚焦到光栅光谱仪的狭缝中，在那里它被光谱分散并由绳状 CCD 相机检测，从而提供用于化学成像和空间木质素分布可视化的拉曼光谱。光栅扫描是通过使用 Piso 电扫描台将样品穿过激光聚焦并记录每个样品位置的拉曼光谱来进行的。
光栅扫描将生成样品的二维光谱图，以生成三维光谱图。沿 Z 方向连续步进激光聚焦，然后堆叠这些二维贴图。通过分析跟进数据采集。
为了可视化木质素分布以进行化学成像和木质素可视化，使用 MATLAB 分析收集的数据。数据排列在一个三维高光谱立方体中，该立方体由两个空间维度和第三个维度组成，用于木质素分析的光谱信号。考虑 1， 550 到 1， 700 平方厘米之间的光谱区域。
木质素的空间分布是通过对基线校正光谱的 1， 550 到 1， 700 平方厘米的强度进行积分来可视化的。基线校正的另一种方法是计算二阶导数谱图并使用二阶导数峰进行分析。通过将 1600 厘米和 1700 厘米倒数厘米之间的三个波段拟合到 gian 峰并评估峰强度下的面积，也可以对木质素定位和化学进行进一步分析，特别是关于授予醛和授予醇部分。
不同光谱图之间的归一化是一个关键步骤，它允许比较不同测量值、组织、样品和物种之间的木质素信号强度。为此，通过 K 均值聚类分类获得平均管腔光谱，并使用外源性 OD 拉伸带的峰高。在平均流明光谱中发现约 2， 500 平方厘米。
作为参考，仔细的样品制备可为合适的植物组织切片提供高质量和空间分辨。例如，使用拉面显微镜获得杨树茎木材在降额水中产生的拉曼光谱。光谱的阴影区域（此处扩展）标记了光谱区域，其中三个峰特别归因于木质素。
通过对 1， 550 到 1， 700 平方厘米的拉面信号强度进行积分，可以获得拉面木质素图像。我们刚刚向您展示了如何使用共聚焦拉面显微镜对植物细胞壁中的木质化进行成像。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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Executive Industry Relevance
Label-free confocal Raman imaging of lignification in plant cell walls enables non-destructive, quantitative assessment of lignin distribution and chemistry in biomass feedstocks. This capability is critical for de-risking bioenergy R&D pipelines by supporting rapid screening of breeding lines and engineered plants for improved biomass conversion. The method advances predictive confidence in feedstock selection and accelerates translational continuity from discovery to pre-commercial evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct, quantitative interrogation of lignification as a key trait in bioenergy crop improvement.
- Supports functional validation of genetic modifications targeting lignin biosynthesis pathways.
- Facilitates mechanistic de-risking by mapping lignin localization and chemistry in situ.
- Improves predictive confidence for downstream biomass conversion performance.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible imaging of lignin content across diverse plant samples.
- Delivers quantitative outputs suitable for high-throughput screening of breeding populations.
- Enables assay scalability and platform reuse for comparative studies across species and genotypes.
- Supports reliable evaluation of cell wall traits relevant to industrial processing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lignin imaging with translational biomarker strategies for feedstock selection.
- Ensures continuity from early discovery through pre-commercial validation of engineered lines.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative lignification profiles.
- Provides mechanistic insights that inform process optimization and feedstock engineering.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the bioenergy R&D continuum from early discovery through lead identification and pre-commercial feedstock evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for lignin biosynthesis and deposition.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative lignin imaging for comparative analysis across samples.
- Analytics: Provides spatially resolved chemical readouts and normalization for robust data comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling direct assessment of lignification in engineered lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, label-free imaging platform for ongoing feedstock characterization efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in feedstock selection.
- Operational Value: Standardizes lignin assessment, enabling reproducibility and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in bioenergy pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetically engineered or bred lines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal Raman microscopy and spectral data analysis.
- Demands access to high-resolution imaging instrumentation and analytical software.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and normalization protocols.
- Adaptable to a range of plant species and tissue types with appropriate optimization.
- Practical limitations include autofluorescence in some samples and the need for careful baseline correction.
