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TALEN 介导的靶向基因整合:使用工程序列特异性核酸酶将荧光蛋白基因精确插入 hiPSC 中
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首先用 PBS 洗涤 iPSC 培养物各 1 次，然后向每个孔中加入 1 毫升 37 摄氏度温和的细胞解离试剂，并在 37 摄氏度下孵育细胞约 5 分钟。当超过 50% 的细胞从培养容器中解离时，使用 P1000 移液器机械破坏任何剩余的细胞团块或附着的细胞。然后，向每个孔中加入 2 mL E8 培养基，并使用 10 mL 移液器进一步将培养物分解成单细胞悬液。
现在，将收获的细胞倒入 15 毫升锥形管中并旋转。将沉淀重悬于最少量的 E8 培养基中进行计数。然后，在通过台盼蓝排除确认培养物的活力及其充分解离后，将 300 万个细胞转移到两个 15 毫升锥形管中。
当细胞离心时，将电穿孔系统设置为人胚胎干细胞系 H9 的细胞类型特异性程序。然后，将 10 μg 同源重组供体单独添加到 1 个沉淀中（用于对照样品），将 10 μg 同源重组供体质粒以及 5 μg 每个 TALEN 质粒加入实验样品中。
接下来，向每个对照和实验沉淀中加入 100 μL 室温完全 P3 原代细胞转染溶液，并重悬细胞。将样品转移到单独的比色皿中，然后对样品进行电穿孔。转染后，立即向每个比色皿中加入 500 μL 室温 E8 培养基，然后将横切的 iPSC 样品逐滴转移到含有 DR4 小鼠胚胎成纤维细胞的 10 cm 培养皿中。
