CRISPR 连接体介导的多基因敲除:一种在小鼠肠道细胞中通过非同源末端连接途径同时敲除多个基因的技术

9 mL 还原血清培养基添加到含有细胞悬液的 15 mL 试管中，并在室温下以 400G 离心 3 分钟。去除所有上清液，并将沉淀重悬于电穿孔溶液中。向两个新试管中加入总量为 10 μg 的 DNA。然后，加入终体积为 100 μL 的电穿孔溶液，并将细胞-DNA 混合物保持在冰上。

将细胞-DNA 混合物转移到电穿孔比色皿中。将比色皿放入电穿孔仪室中。按下电穿孔仪上的相应按钮测量阻抗，并确保其为 0.030 至 0.055 欧姆。根据文本协议中指示的设置进行电穿孔。向比色皿中加入 400 μL 电穿孔缓冲液和 ROCK 抑制剂，然后将其所有内容物转移到 1.5 mL 试管中。

在室温下孵育 30 分钟，让细胞恢复。30 分钟后，在室温下以 400G 离心 3 分钟。去除上清液，将沉淀重悬于每孔 20 μL 的基底基质中。在 48 孔板中每孔接种大约 1 x 10⁴ 至 1 x 10⁵ 个细胞，并添加 EGF 加 Noggin GSK-3 抑制剂、ROCK 抑制剂和 1.25% 二甲基亚砜培养基。在 37 摄氏度下孵育。