Name: 活体成像和治疗卵巢癌的原位小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 了解原位小鼠模型在卵巢癌研究中的应用，通过向小鼠卵巢囊注射荧光素酶表达的人卵巢癌细胞，结合活体成像技术实时追踪肿瘤生长、分布及药物疗效。该方法为评估新型治疗方案提供了更接近人类疾病的临床前研究平台。

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我们感谢哈维·亨斯利博士（Dr. Harvey Hensley）提供的专业技术支持。本研究受益于福克斯蔡斯癌症中心（Fox Chase Cancer Center, FCCC）以下设施的使用：动物实验设施和小动物影像设施。本工作部分得到了FCCC/宾夕法尼亚大学卵巢癌SPORE项目（P50 CA083638）、FCCC核心资助（P30 CA006927）以及卵巢癌研究基金的资助。

I. 卵巢肿瘤细胞的制备
<ol>
<li>	培养表达荧光素酶的卵巢癌细胞系。荧光素酶的来源可以是萤火虫、海肾或其他物种。表达荧光蛋白的细胞也可使用。本实验中采用表达萤火虫荧光素酶的卵巢癌细胞系 OVCAR5。</li>
<li>	采用常规细胞培养技术收集细胞。</li>
<li>	将细胞悬液（10,000 个细胞/μL）置于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在冰上保存，直至注射时使用。</li>
</ol>

II. 囊内注射
该操作需要第二个人协助。所有外科手术均在无菌条件下进行，包括穿戴外科手术服以及使用无菌外科器械、注射器和针头。
<ol>
<li>	通过混合3 mL盐酸氯胺酮（100 mg/mL）、1.6 mL盐酸赛拉嗪（100 mg/mL）、1.5 mL乙酰丙嗪（10 mg/mL）以及20 mL 0.9%氯化钠溶液，配制麻醉剂溶液。</li>
<li>	检查动物的编号及可观察的健康状况。通过腹腔（i.p.）注射方式，使用配制好的氯胺酮-赛拉嗪-乙酰丙嗪麻醉剂，剂量为8~9 mL/kg体重（BW），对动物实施麻醉。</li>
<li>	用镊子或手指对动物后肢足趾进行夹捏测试，以确认动物已达到可接受的麻醉深度。若存在足底反射，需等待麻醉加深，直至动物对该操作无反应。</li>
<li>	将动物仰卧置于无菌纱布垫上，头部朝外，尾部朝向操作者。切口位置位于腹中线左侧或右侧，且位于卵巢上方。用70%酒精湿润或剃除切口部位的毛发。</li>
<li>	用镊子提起湿润的皮肤，在背内侧位置、卵巢脂肪垫正上方用剪刀做一小切口。卵巢脂肪垫应可见于腹膜壁表面之下。其颜色呈白色，与周围深粉红色组织形成鲜明对比，易于识别。</li>
<li>	轻柔提起腹膜壁内层组织，并按上述方法（第5步）做一小切口。</li>
<li>	在切口旁的中线位置放置一块浸有生理盐水的无菌纱布垫。找到卵巢脂肪垫，轻柔将其拉出并置于纱布上。用动脉夹夹住脂肪垫以固定卵巢。在解剖显微镜下调整卵巢位置，以便将针头（30 G）插入通向卵巢囊的输卵管弯曲处。当针头插入正确位置时，应在卵巢囊下方可见针头。</li>
<li>	将注射器置于注射部位后，轻柔推动注射器推杆，向卵巢囊与卵巢之间注入5 μL细胞悬液。此步骤需两人配合完成：一人推动推杆，另一人保持针头位置稳定。注射完成后迅速拔出针头以封闭穿刺点，但动作需轻柔，避免撕裂卵巢囊及输卵管。正确注射后，卵巢囊应呈现轻微膨胀状态。</li>
<li>	松开动脉夹，释放脂肪垫，并将生殖道及脂肪垫轻柔复位至腹膜腔内。通过将上方腹膜组织拉过下方组织的方式轻柔闭合腹壁。使用外科缝钉或伤口夹闭合皮肤。</li>
<li>	将恢复中的动物放回笼中，并提供安全的热源，以防低体温并加快恢复。监测呼吸频率与节律、肌张力恢复情况以及自主活动能力，这些均为恢复进程的良好指标。术后7天或更久后可拆除缝钉或伤口夹。</li>
</ol>

III. 口服灌胃给药
<ol>
<li>	使用带有圆头的18~20 G灌胃针或饲管。灌胃针的长度不应超过动物头部前端至最后一根肋骨的距离。</li>
<li>	核对动物的编号及可观察的健康状况。用拇指和手指轻轻抓起动物肩部背侧的皮肤以固定动物。固定力度应适中，使前肢向两侧伸展并避开操作区域。动物不应能够抓到灌胃针。</li>
<li>	用食指轻轻向后牵拉动物头部，使其颈部与食道呈一条直线。用拇指内侧支撑动物背部。</li>
<li>	将灌胃针从口腔一侧轻柔地、无阻力地插入，并越过舌面。应以一个流畅的动作使针沿上颚后壁进入食道。重力应能引导针顺利下行而无阻力。若遇到任何阻力，应立即退出针头并重新操作。插入过程中可能引发动物的咽反射和吞咽反射，但动物不应出现抵抗或喘息。针头在位时，必须通过观察鼻孔和胸部的运动确认动物正常呼吸。</li>
<li>	缓慢推动注射器活塞，以注入所需剂量的液体。</li>
<li>	沿插入时的相同角度和路径，轻柔地将灌胃针从食道中撤出。</li>
<li>	将动物放回笼中，并观察其呼吸和行为5~10分钟。</li>
</ol>

四、 在体实验 成像
我们使用Caliper生命科学系统来监测注射到囊腔内细胞的行为。利用该系统进行的实验通常在肿瘤植入后4~16周的时间范围内进行。
<ol>
<li>	通过将5~20 mg D-荧光素（萤火虫荧光素酶的底物）溶解于1 mL PBS中，并经0.22 μm滤膜过滤除菌，制备D-荧光素溶液。</li>
<li>	开启氧气和异氟烷气体，为诱导室充气。仅打开通往诱导室的气体流量。在动物准备成像前，异氟烷气体流速应保持在较低水平。</li>
<li>	核对动物的编号及其可观察的健康状况，将动物放入已充入异氟烷气体的诱导室中。</li>
<li>	当动物表现出麻醉状态时，将其从诱导室中取出。使用30 G针头经腹腔注射200 μL已配制的荧光素溶液。务必记录注射时间，以确保在整个研究过程中，荧光素注射与成像之间的时间间隔保持一致。</li>
<li>	将注射完荧光素的动物重新放回诱导室中。</li>
<li>	将成像系统设置为适当的参数。在采集第一只动物图像前，务必先初始化系统。</li>
<li>	关闭通往诱导室的气体流量，打开通往成像室的气体流量。</li>
<li>	将麻醉后的动物以背侧或腹侧朝上的体位放置。确保动物的鼻部位于鼻罩内，以维持适当的麻醉状态。确保动物位于绿色照明指示的“感兴趣区域网格”内。</li>
<li>	关闭成像室门，并在适当的时间点采集图像。成像时间可根据动力学曲线确定。</li>
<li>	将动物从成像室中取出，并放回其笼中。按照“囊内注射”部分所述方法监测动物的恢复情况。</li>
</ol>

V. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2125/2125fig1.jpg" alt="活体成像，小鼠背腹面，荧光发射，实验结果，热图分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 体内 卵巢肿瘤细胞在原位小鼠模型中的成像。表达荧光素酶的OVCAR5细胞被注射至右侧卵巢包膜内，并随时间进行成像。图像分别在注射后第13天（左）、第17天（中）和第22天（右）使用IVIS Spectrum成像系统采集。上层面板显示背侧视图，下层面板显示腹侧视图。请注意，在注射后22天可见肿瘤细胞的腹膜扩散。
动物实验按照福克斯蔡斯癌症中心机构动物照护与使用委员会制定的指南和规定进行。

<ol><li>Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).</li>
<li>Lynch, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+ovarian+carcinoma%3A+heterogeneity%2C+molecular+genetics%2C+pathology%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Hereditary ovarian carcinoma: heterogeneity, molecular genetics, pathology, and management.</a> Mol Oncol. 3, 97-137 (2009).</li>
<li>Yap, T. A., Carden, C. P., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+chemotherapy%3A+targeted+therapies+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Beyond chemotherapy: targeted therapies in ovarian cancer.</a> Nat Rev Cancer. 9, 167-181 (2009).</li>
<li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+models+are+necessary+to+predict+therapy+of+transplantable+tumors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 17, 279-284 (1998).</li>
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<li>Greenaway, J., Moorehead, R., Shaw, P., Petrik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-stromal+interaction+increases+cell+proliferation%2C+survival+and+tumorigenicity+in+a+mouse+model+of+human+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-stromal interaction increases cell proliferation, survival and tumorigenicity in a mouse model of human epithelial ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 108, 385-394 (2008).</li>
<li>Connolly, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models of ovarian cancer.</a> Cancer Treat Res. 149, 353-391 (2009).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging.</a> Proc Am Thorac Soc. 2, 537-540 (2005).</li>
<li>Lehmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+and+multimodal+in+vivo+imaging+of+tumor+hypoxia+and+its+downstream+molecular+events%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Longitudinal and multimodal in vivo imaging of tumor hypoxia and its downstream molecular events.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 14004-14009 (2009).</li>
<li>Connolly, D. C., Hensley, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenograft+and+Transgenic+Mouse+Models+of+Epithelial+Ovarian+Cancer+and+Non-Invasive+Imaging+Modalities+to+Monitor+Ovarian+Tumor+Growth+In+Situ%3A+Applications+in+Evaluating+Novel+Therapeutic+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacoogy%22%5BJournal%5D)">Xenograft and Transgenic Mouse Models of Epithelial Ovarian Cancer and Non-Invasive Imaging Modalities to Monitor Ovarian Tumor Growth In Situ: Applications in Evaluating Novel Therapeutic Agents.</a> Current Protocols in Pharmacoogy. 45, (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

卵巢癌是所有妇科恶性肿瘤中致死率最高的疾病1。该疾病高死亡率的主要原因在于其晚期诊断以及缺乏可靠的诊断方法2。此外，传统化疗常常面临化疗耐药性和癌症复发的问题3。因此，亟需开发新的治疗手段以有效靶向该疾病。在研发针对人卵巢癌的新疗法过程中，建立具有代表性的动物模型至关重要。

原位动物模型相较于传统的异种移植模型（例如肿瘤细胞的皮下或腹腔内注射）具有以下优势：1）能够重现肿瘤形成的原发部位；2）能够代表常见的转移部位；3）可使肿瘤细胞与合适的微环境相互作用4, 5, 6, 7, 8。啮齿类动物具有一种独特的卵巢囊膜结构，该膜包裹卵巢并与输卵管相延续。这种独特的解剖结构使得卵巢肿瘤细胞能够被原位注射。在囊内注射的卵巢肿瘤细胞表现出与人类疾病相似的行为，随着肿瘤进展，细胞在囊膜内生长并扩散至腹腔。稳定表达荧光素酶或荧光蛋白的细胞还可实现实时追踪肿瘤细胞行为。生物发光和/或荧光成像技术使得在较长时间内对肿瘤细胞进行重复成像成为可能，从而以非侵入性方式研究肿瘤的生长、分布及消退过程9, 10, 11。

在建立卵巢原位模型时，注射后需迅速将针头从滑膜囊中拔出。快速拔出针头可封闭穿刺部位，防止注射细胞外漏。但同时操作应轻柔，避免撕裂滑膜囊。若注射过程中发生外漏，可能导致细胞在腹腔内定植，从而干扰实验结果，例如肿瘤细胞在卵巢外过早扩散。一旦发生此类情况，应记录该实验动物，并在治疗前监测其腹膜内多部位肿瘤的形成，或将其从后续分析中剔除。在实施口服灌胃前，必须通过测量动物头部顶端至最后一根肋骨的长度来确认灌胃管的合适长度。建议在动物鼻部位置对灌胃管做标记，插入时不得超过该标记，否则可能导致胃穿孔。对于年轻动物或体重低于20 g的动物，确定管长尤为关键。将灌胃针沿食管插入时，不应遇到明显阻力，动物也不应出现挣扎。给药溶液或混悬液的推注速度不宜过快，以免引起反流，导致给药剂量不准确，并增加动物应激反应。为获得可比的成像结果，建议在荧光素酶底物注射后至成像的时间间隔保持一致。该时间间隔可通过在底物注射后连续采集图像并观察信号动力学变化来确定。卵巢癌小鼠原位模型的建立、药物口服给药及 体内 成像技术对于深入了解卵巢癌的发展与扩散，以及评估可能最终改善这种致命疾病患者预后的新型治疗方案，是必要的手段。

<table><tbody><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Vedco, Inc.</td><td>暂无</td><td></td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>暂无内容</td><td></td></tr><tr><td>乙酰丙嗪</td><td>Vedco, Inc.</td><td>暂无内容</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Substrates" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td>122796</td><td></td></tr></tbody></table>

体内成像与卵巢癌小鼠原位模型中的治疗处理

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

人源性癌症及其对治疗的反应在原位动物模型中能得到更准确的呈现。本文描述了一种卵巢癌原位小鼠模型的建立方法，通过口服给药方式进行癌症治疗，并利用实时成像技术监测肿瘤细胞对药物治疗的反应行为 体内 成像系统。在此原位模型中，将表达荧光素酶的卵巢肿瘤细胞直接注射到包裹每侧卵巢的小鼠囊腔内。注射荧光素酶底物D-荧光素后，表达荧光素酶的细胞产生生物发光信号。该信号由 体内 成像系统，可对单只动物的肿瘤生长、分布及消退情况进行无创监测。通过口服灌胃给药可将最大剂量为10 mL/kg体重的药物直接递送至胃部，接近临床治疗中的药物给药方式。因此，本文所述技术包括卵巢癌原位小鼠模型的建立、药物的口服给药以及 体内 成像技术有助于更好地理解人类卵巢癌及其治疗，将提升对该疾病的有效靶向。

卵巢癌的原位动物模型能更好地模拟人类疾病，因此有助于加深对癌症进展及肿瘤治疗反应的理解。小鼠模型通过包膜内注射表达荧光素酶的卵巢肿瘤细胞建立。治疗通过口服灌胃给药。肿瘤生长通过生物发光成像进行监测。 体内 成像系统

与异位动物模型相比，原位动物模型能更真实地反映人类癌症及其对治疗的反应。本文描述了一种原位小鼠模型的建立方法……

in-vivo-imaging-therapeutic-treatments-an-orthotopic-mouse-model

Research

科研

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Biology

生物学

活体成像和治疗卵巢癌的原位小鼠模型

为了研究 体内 肿瘤生长与肿瘤微环境，我们采用免疫功能健全动物中的同源性、原位卵巢癌小鼠模型。我们将小鼠肿瘤细胞系（MOV1）转导表达Katushka荧光蛋白（MOV1）KAT）在此我们展示其在卵巢中的原位移植 体内 成像...

用于免疫健全小鼠的浆液性卵巢癌原位模型 体内 肿瘤成像与肿瘤免疫应答的监测

在本视频中，我们展示了在小鼠模型中进行卵巢癌细胞的子宫内注射。这种原位小鼠模型有助于我们无创地监测肿瘤生长，并评估新疗法在预防和治疗复发性卵巢癌方面的有效性。...

子宫内癌细胞注射：一种用于建立腹腔内卵巢癌小鼠模型的癌细胞递送技术

本视频介绍了用于研究肿瘤发生及腹膜转移的鼠类实验模型的建立方案。该卵巢癌模型通过将人卵巢上皮癌细胞原位接种至雌性小鼠的卵巢而建立。...

将卵巢癌细胞原位接种至小鼠卵巢：建立用于研究癌细胞腹膜播散的卵巢癌小鼠模型的操作步骤

关键词：卵巢癌，小鼠模型，原位接种，腹膜播散，癌细胞转移，卵巢，动物实验

我们描述了一种非侵入性动物成像平台，可用于检测、定量和监测卵巢癌的生长及复发。这种腹腔内异种移植模型模拟了卵巢癌患者的临床特征。...

用于非侵入性成像检测与监测卵巢癌复发的小鼠模型

我们概述了一种同时实施两种方法的实验方案 体内 和 离体...

体内 与 离体 研究卵巢癌转移定植腹膜脂肪中乳斑结构的方法

卵巢癌转移的特点是存在大量弥散性腹膜内病灶，因此准确目视量化肿瘤负荷具有挑战性。本文描述了一种方法 原位 和 离体...

腹腔内卵巢癌转移的定量分析

为了阐明卵巢癌腹膜播散的多步骤过程，本研究通过将这些肿瘤细胞进行原位接种，建立了一种小鼠实验模型，用于原发肿瘤的形成及腹膜转移的研究。<br...

小鼠原位接种卵巢癌细胞构建原发肿瘤及腹膜转移的实验模型 via 正位接种卵巢癌细胞

该论文描述了一种方法，用于建立原位注射乳腺肿瘤后自发性肺转移模型，并对转移级联各阶段进行纵向生长监测，适用于干预转移过程的各个阶段。...

体内成像检测原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

本方案描述了一种癌细胞与大网膜相互作用的三维（3D）ex vivo...

一个 离体 利用人网膜建立卵巢癌腹膜转移模型

本文介绍了一种建立腹腔内和包膜内肿瘤模型的逐步实验方案，用于研究卵巢癌的进展、转移及治疗反应。此外，我们还描述了如何在这些模型中利用基于荧光素酶的非侵入性活体成像技术，在小鼠体内监测肿瘤的进展。...

用于研究小鼠转移性卵巢癌及治疗反应的临床相关可移植肿瘤模型

了解原位小鼠模型在卵巢癌研究中的应用，通过向小鼠卵巢囊注射荧光素酶表达的人卵巢癌细胞，结合活体成像技术实时追踪肿瘤生长、分布及药物疗效。该方法为评估新型治疗方案提供了更接近人类疾病的临床前研究平台。

体内成像与卵巢癌小鼠原位模型中的治疗处理

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