基于 Chip-in-a-Tube 的数字 PCR，用于定量单核苷酸变异

数字聚合酶链反应 （dPCR） 可用于定量单核苷酸变异 （SNV） 突变，其中单个核苷酸在基因组中的特定位置被取代，从而产生两个核苷酸变异或等位基因。

要使用 chip-in-a-tube dPCR 技术开始定量，请取含有 SNV（突变等位基因和相应的野生型等位基因）的 DNA 样品。添加含有热稳定 DNA 聚合酶、dNTP 和引物的混合物。

接下来，添加等位基因特异性寡核苷酸探针（用不同颜色荧光的报告基因标记以区分等位基因）和淬灭分子。淬灭基团与报告基团的接近会抑制其荧光。

将溶液分配到微流体芯片的反应室中。每个包含等位基因的腔室都用作独立的反应容器。

将带有芯片的试管放入热循环仪中，然后开始反应。在高温下，双链 DNA 变性成单链。降低温度以将引物和寡核苷酸探针退火到它们的互补区域。

在适当的延伸温度下，DNA 聚合酶延伸引物并切割探针。与淬灭基团的距离使报告基团能够发射荧光基团。

读取不同颜色的荧光信号，并创建位置图以检测包含等位基因的腔室。

为了确定突变等位基因的频率（变异等位基因分数），计算包含突变体与野生型等位基因的腔室的比率。