共培养模型绿脓杆菌现场人类呼吸道细胞生长的生物膜

本文介绍了成长的不同方法

该程序的总体目标是在活人气道上皮细胞的顶端表面生长气原假单胞菌生物膜。这是通过首先在塑料表面或玻璃盖玻片上建立融合的单层气道上皮细胞来实现的。该程序的第二步是组成型培养 p 气原菌的培养物，表达绿色荧光蛋白。

下一步是将细菌和气道细胞置于静态设置或流通室中相互接触。该程序的最后一步是让细菌生物膜随着时间的推移而发展，同时评估气道细胞的活力。通过荧光显微镜可以获得显示活气道细胞上生物膜形成的结果。

该技术的意义延伸到囊性纤维化患者的治疗，因为这些共培养模型可用于开发和验证新的抗生素方案，能够根除导致气道慢性定植的生物膜。在囊性纤维化患者中，静态共培养生物膜模型使用 CFBE 细胞，这些细胞是永生化的人类气道。上皮细胞最初由囊性纤维化个体发育而来，在细菌接种前 7 至 10 天将 CFBE 细胞接种到 24 孔组织培养板中。

我们以每孔 2 倍 10 至第 5 个细胞的浓度接种在 0.5 毫升最低必需培养基或 MEM 中，补充有 10% 胎牛血清、2 毫摩尔 L-谷氨酰胺、50 单位/毫升、青霉素和 50 微克/毫升。链霉素在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下使细胞生长。95%空气 7 到 10 天每 2 到 3 天更换一次介质。

这些条件将导致在实验前一天形成汇合、单层和紧密连接。用冷冻原液中的 pierro gen 接种 5 ml LB 培养物，并在 37 摄氏度下在旋转器上生长 18 小时。在 200 RPM 时，我们使用携带 PSMC 21 质粒的 p aerogen 在细菌接种当天进行 GFP 的组成型表达。

从 CFPE 细胞中取出培养基，并加入等体积的显微镜培养基，即不含酚红的 MEM，补充有两毫摩尔 L-谷氨酰胺接种物汇合，带有 posa 的 CFBE 单层感染倍数约为 30：1，相对于最初接种用于 24 孔板的 CFBE 细胞数量。这相当于每毫升 0.5 毫升 MEM 中第七 CFU 的 1.2 倍 10。将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳、95% 空气下孵育 1 小时。

孵育 1 小时后，取出 snat 并更换为新鲜显微镜。培养基补充有 0.4% 精氨酸。精氨酸的添加会延迟单层的破坏，使其在 CFPE 细胞上形成生物膜。

板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳、95% 空气下孵育不同的时间点，每隔几个小时最多孵育约 8 小时。使用显微镜分析 CFBE 单层的完整性和生物膜的生长。流动池共培养生物膜模型需要在直径为 40 毫米的玻璃盖玻片上形成汇合的 CFBE 细胞单层。

为此，首先将无菌盖玻片放入直径为 60 毫米的无菌塑料培养皿中。然后加入 3 毫升预热的细胞生长，用移液管尖端中压在盖玻片上，以去除滞留在下面的任何气泡，并将盖玻片压到塑料培养皿种子的底部，每皿 10 倍至第六个 CFBE 细胞的两倍。轻轻地来回摇动培养皿，但避免旋转，以防止细胞靠在培养皿的侧面离心。

将培养皿置于 37 摄氏度的 5% 二氧化碳、95% 空气培养箱中 8 到 10 天。每隔一天用 3 毫升新鲜生长培养基喂养细胞。在这些条件下，细胞将在玻璃盖玻片上形成汇合的单层。

下一步是在实验前一天制备 P 气原细菌菌株。在 5 毫升 LB 中，在 37 摄氏度下在旋转器上培养 p aerogen 18 小时。在 200 RPM 时，我们使用 P 气原菌株 PO one，携带 PSM C 21 质粒，在实验当天用于 GFP 的组成型表达。

将 1 毫升细菌培养物放入无菌微量离心管中，并以 6， 000 RPM 离心 3 分钟。在一毫升显微镜中洗涤细菌沉淀两次。培养基将 0.5 毫升洗涤并重悬的细菌稀释到 4.5 毫升显微镜培养基中，以达到每毫升八分之一 CFU 的浓度约为 5 乘以 10

现在我们已经准备好实时观察 CFPE 细胞，这需要一个与蠕动泵耦合的成像室，以确保营养物质长时间流动。对于温度控制器，我们使用标准的生物膜流通池装置。生物技术公司 FCS 双腔室经过改良，可容纳 CFPE 细胞。

流动池共培养生物膜模型中最关键的步骤之一是在不损坏细胞监测器的情况下组装腔室 组装腔室。将腔室的上半部分倒置，以便可以看到灌注管，并将 0.75 毫米厚的橡胶垫圈的间隙孔对准灌注管。将带有腔室的微型渡槽滑轨堆叠在橡胶垫圈顶部，确保带槽的一面朝上。

然后在载玻片顶部放置另一个橡胶垫圈。第二个垫片的厚度和内部几何形状将决定腔室的体积。接下来，在载玻片中心添加 1 毫升预热显微镜培养基。

将成像室放在无菌表面上，同时从细胞培养箱中取出 CFPE 细胞。从培养皿中取出用过的培养基，用 3 毫升预热显微镜培养基洗涤 CFPE 细胞一次。使用乙醇洗涤的镊子。

从培养皿中取出盖玻片，并将其倒置到放置在腔室上的显微镜培养基珠上。盖玻片现在放在第二个橡胶垫圈上，单层气道细胞朝下。一只手握住组装好的组件，将腔室的底座放在堆栈顶部，然后迅速翻转腔室，使一切都正面朝上。

转动环将底座锁定到位。将入口管连接到低流量微量灌注泵。第二根管路将泵连接到放置在 37 摄氏度水浴中的显微镜介质。

位于显微镜旁边。以每小时 20 毫升的速率开始流路。该流速在 posa 的游泳速度能力范围内。

将无菌预切的一根第 16 CFL 管连接到腔室的入口和出口灌注管上，然后连接温度控制器。将组装好的腔室放在倒置荧光显微镜的显微镜载物台上。使用 1 毫升一次性注射器。

使用放置在泵和腔室之间的双向阀将先前制备的细菌悬浮液注入腔室，以使细菌附着在气道细胞上。停止泵 2 小时。2 小时后，可以重新启动液流并保持在每小时 20 mL

对于实验的其余部分，通过差分干扰监测气道细胞的完整性。在整个实验过程中对比显微镜检查单层损伤的迹象。同时跟踪气道细胞顶端表面 GFP 标记的 p 气原生物膜的发育。

通过在静态和流通池测定中使用倒置共聚焦或宽场荧光显微镜获取图像，发现 CFPE 单层可以在接种后承受 p 气原的存在长达 8 小时，而没有任何改变迹象。上皮单层完整性可以通过相差显微镜使用倒置来评估，如在组织培养板上生长的 CFPE 细胞汇合单层的实例所示。随着时间的推移，p aerogen 会产生毒素和毒力因子，这些毒素和毒力因子可以完全或分段破坏上皮细胞单层。

在这个受损的 CFPE 单层示例中，可以看到绿色所示的 P 气原细菌在上皮细胞的紧密连接之间传播并进入基底外侧膜。由于单层劣化，在这些条件下通常无法形成生物膜。该图显示了在成功支持生物膜形成后 24 小时观察到的过度生长的 p 气原生物膜。

CFPE 单层已损坏无法修复，现在几乎不存在。残留的生物膜以平坦的细菌层生长，附着在玻璃盖玻片上。当气道单层的完整性不受损害时。

在两种共培养模型中，P 气原生物膜都可以在气道细胞的顶端表面成功形成和发育。此处显示的是表达 p 气原生物膜的代表性图像，该生物膜使用通过落射荧光显微镜评估的静态共培养生物膜模型在 CFPE 细胞的汇合单层上生长。该图像是面部对比通道和荧光通道的叠加。

下一张图显示了标记的 p aerogen 的 GFP。使用流动池共培养生物膜模型，生物膜在 CFBE 细胞的汇合单层上生长 6 小时，以促进气道的可视化。在接种 posa 之前，用 HEXT 3 33 42 对单层细胞核进行染色，呈蓝色。

表现为附着在 CFPE 细胞顶端表面的绿色团块的薄膜分散在气道细胞上。这里显示了 3D 重建后在 A-C-F-P-E 细胞单层上形成的 6 小时大的气原生物膜的典型蘑菇状结构。观看本视频后，您应该对如何使用此处描述的共培养模型并与标准微生物学方法和荧光显微镜耦合，在已建立的单层气道细胞上成功生长和可视化细菌生物膜有很好的了解。