前肿瘤反应性T细胞的体外扩增Bryostatin 1/Ionomycin手段和共同的γ链细胞因子配方

本实验的目标是通过 Brios 他汀类药物诱导 T 细胞激活 1 离子霉素，以及通过 γ 链细胞因子分化 T 细胞，从脾脏和淋巴结中分离肿瘤致敏 T 细胞开始。然后用 brios 他汀类药物 1 和 离子霉素激活 2 细胞内信号模拟物，分别增加蛋白激酶 C 活性和细胞内钙。在 IL 7、IL 15 和 IL 2 存在下培养，用于肿瘤反应性 T 细胞的分化和扩增。

干扰素 γ EISA 的结果与细胞毒性测定事实的强大结合可以阐明扩增的 T 细胞的肿瘤反应性，并为过继免疫治疗提供潜在的见解。这种肿瘤反应性 T 细胞的体外扩增方法可以帮助回答肿瘤免疫学问题中的关键问题，例如常见的 γ 成像细胞因子在肿瘤反应性 T 细胞分化中的作用是什么。以及每种 T 细胞表型（如效应细胞、效应记忆细胞和中枢记忆细胞）在产生针对癌症的长期记忆反应中的作用。

淋巴结和脾脏的绝缘以及淋巴细胞的败血症处理是难以实施的程序，但可以很快学会。通过观察。FVBN 2 0 2 转基因雌性小鼠在 MMTV 启动子的调节下表达灭活大鼠新转基因，结果在 4 至 10 个月大时发展为自发性乳腺癌。

在该方案中，这些自发性荷瘤小鼠用作肿瘤反应性 T 细胞的供体。首先，从携带 FVBN 2 0 2 转基因小鼠中分离出肿瘤引流淋巴结和脾脏。现在，在冰冷的 RPMI 1640 中制备单细胞悬液，补充有 10% FB sce A 培养物，以 10 至 6 个细胞/毫升在含有 15% FBS 和 1 微摩尔 cin 的 5 纳摩尔布里奥斯他汀类药物 1 和 80 单位/毫升的完全培养基中。

将 IL 2 在 37 摄氏度下平衡的 PMI 培养基中培养 16 小时，洗涤细胞 3 次，然后在 10 ng/mL 的完全培养基中以 10 至 6 个细胞/毫升的浓度培养 IL 7 和 IL 15 各培养 24 小时。为了进一步激活细胞脉冲，每毫升添加 40 个单位的 IL 2 持续 24 小时。现在分液细胞并以每毫升 10 纳克的浓度培养它们，必要时 IL 7 和 IL 15 各培养 4 天，更换培养基并每两天分液细胞。

通过离心收获扩增的原代 T 细胞，通过光学显微镜计数细胞并计算 T 细胞的倍数扩展。现在准备用于流式细胞术的细胞，以确定 CD 8 阳性和 CD 4 阳性 T 细胞的比例。首先，将细胞与抗 CD 16、CD 32 抗体在冰上孵育 20 分钟，以阻断抗体与 FC 受体的非特异性结合。

然后用两毫升添加 1% 叠氮化钠的冰冷 PBS 洗涤细胞两次，与 Fitz CD four 和 PE CD 8 抗体在冰上孵育 20 分钟，对细胞进行染色。用两毫升补充有 1% FBS 和 0.1% 叠氮化钠的冰冷 PBS 洗涤两次。最后，用 1% 多聚甲醛固定细胞，并在 Beckman Coulter FC 500 上使用 summit 4.3 版软件在六个孔培养板中分析样品，以 10 比 1 的效应器与目标比例移液 T 细胞与乳腺肿瘤细胞，每孔 3 毫升。

每毫升含有 20 单位 IL 的完全培养基，两次在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 48 小时。根据制造商的方案门控事实，对新的阳性肿瘤细胞进行三色抗体染色，然后进行 PE 抗 US IgG 和 Xin 五片和碘化丙啶染色，并用 Xin 五 pi 分析肿瘤细胞的活力。用 BI 激活 T 细胞 16 小时导致杀死体内对肿瘤不敏感的幼稚 T 细胞。

在肿瘤反应性 T 细胞的 bi 选择性之后，它们在 6 天的培养中与 γ 链细胞因子一起扩增高达 2.8 倍，CD 8 阳性和 CD 4 阳性 T 细胞与 γ 链细胞因子相同扩增。经过 6 天的离体培养后，离体扩增的 T 细胞对供体小鼠敏感的肿瘤表现出高反应性，如干扰素 γ 的产生所评估的那样。在存在新的阳性小鼠乳腺癌或 MMC 肿瘤细胞的情况下，离体扩增的 T 细胞可以诱导新的阳性 MMC 肿瘤细胞凋亡，使得肿瘤细胞的活力在 48 小时内从 92% 下降到 61%。

在尝试此程序时，您应该记住在无菌条件下工作。观看此视频后，您应该对如何选择和扩增肿瘤活性 T 细胞进行癌症适应性 T 细胞治疗有很好的了解。