氧通量测量以评估活细胞和透化细胞中的线粒体呼吸

将哺乳动物细胞悬液装入装有培养基的呼吸计室中，并用塞子密封它们，以创建一个用于氧气测量的封闭系统。

每个腔室内的传感器可测量实时氧通量，即细胞耗氧率。

通过塞子注射洋地黄皂苷以透化细胞膜，使胞质成分扩散出去。

这降低了线粒体电子传递链的底物可用性，从而降低了氧通量。

引入丙酮酸和苹果酸，它们进入线粒体并产生电子载体。

这些载流子向 ETC 的复合物 I 和 II 提供电子，启动电子转移并增加氧通量。

注射ADP启动ATP合成，进一步提高氧通量。

接下来，逐步滴定解偶联器以破坏质子梯度，使氧通量最大化。

最后，注射抗霉素A抑制复合物III，停止电子传输并最大限度地减少氧通量。

该通量曲线揭示了透化细胞中的线粒体呼吸。

首先，将线粒体呼吸培养基MiR05加入干净的Oroboros室中。插入塞子以关闭腔室，并使用抽吸系统从塞子容器中吸出多余的介质。

在添加HEK 293T细胞之前，计算达到每毫升100万个细胞的实验浓度所需的细胞原液悬浮液体积。

然后，从腔室中取出塞子并将其放在机架上。使用移液器，从腔室中取出与计算的细胞原液悬浮液体积相对应的 MiR05 Vout 体积。

使用移液器彻底重悬细胞原液悬浮液后，将计算出的体积添加到腔室中。

要关闭腔室，请插入塞子，确保没有气泡滞留在内部。用抽吸系统从塞子容器中吸走任何多余的液体。

等待氧通量稳定，通常需要大约 15 分钟。

氧通量的痕迹显示在两个腔室的上面板上，而氧浓度显示在下面板中。

要制备微量注射器，请根据要滴定的化学品类型和体积选择并清洁合适的注射器。将微型注射器放在注射器架上。

现在，根据呼吸底物-解偶联剂-抑制剂滴定或 SUIT 方案将化学品装入注射器，避免气泡。填充注射器至少比所需体积多 1 微升。

按下柱塞，直到达到玻璃桶上所需的标记，确保针尖出现一小滴。在进行滴定之前，擦去化学瓶壁上的液滴。

滴定时，针头应完全插入塞子毛细管，直到玻璃桶的端头与塞子接触，并且必须将化学品迅速注入腔室。

要开始这个特定的SUIT方案，请在两个腔室中将洋地黄豆苷添加到每毫升5微克的实验浓度中。然后，在事件窗口中单击确定，为两个腔室设置相应的事件。

从塞子容器中吸出多余的液体。等待氧通量稳定并记录至少 2 分钟。

将丙酮酸滴定到两个腔室中，然后滴定苹果酸以达到各自的实验浓度。在事件窗口中单击确定。

现在，从塞子容器中吸出多余的液体，等待助焊剂稳定，然后记录约 2 分钟。

然后，将 ADP 添加到 2.5 毫摩尔的实验浓度中，并在事件窗口中单击“确定”。

清除多余的液体后，等待助焊剂稳定。助焊剂可能需要长达 20 分钟才能稳定下来。

然后，以 0.5 微摩尔的增量使用 CCCP 重复该过程，以达到最大通量。

加入抗霉素A以达到2.5微摩尔的实验浓度。

达到通量稳定后，单击标有停止测量的按钮。

对于数据分析，将布局从叠加切换到单独的腔室。在通量图的稳定和代表性部分设置标记，避免滴定伪影。

从顶部菜单中选择“标记”，然后选择“标记统计信息”。从下拉菜单“统计模式”中选择中位数，然后单击复制到剪贴板以传输数据以进行进一步分析。