Name: Hyponeophagia:在小鼠的焦虑测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 学习使用小鼠新奇食物抑制实验测量焦虑水平的方法。通过记录进食潜伏期评估焦虑反应，采用小型测试场地减少探索行为干扰。该方法为神经科学研究提供了可靠的焦虑行为学评估工具。

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感谢威康信托基金会为牛津大学提供开放获取资金支持。Robert Deacon 是牛津大学 OXION 研究组成员，该研究组由威康信托基金会资助（项目编号：WT084655MA）。

1. 引言：
小鼠和大鼠在初次接触一种新食物时，通常只会摄入少量。这被认为是因为它们无法呕吐，容易中毒所致。
唯一的例外是，当它们此前接触过另一只食用过该食物的动物时；如果它们从同伴呼出的空气中闻到该食物的气味，就会将其视为安全的13。这是因为食物气味与另一只大鼠呼吸中含有的二硫化碳同时出现12。事实上，二硫化碳本身可增加小鼠和大鼠的食物摄入量17。这一现象被称为“食物偏好的社会传递”，可作为一种简单的嗅觉学习范式加以利用22。有研究报道，该过程对海马体损伤敏感3，但其他研究5未能重复出这一结果。有学者提出，新皮层胆碱能系统，尤其是眶额叶组分19，在食物偏好的社会传递中可能比海马体胆碱能系统更为重要。已有研究表明，社会传递能力甚至可用于追踪老龄大鼠的记忆障碍，这可能由老龄海马体中CREB（cAMP反应元件结合蛋白）信号传递功能下降所介导7。
啮齿类动物通过社会传递方式轻易形成食物偏好的特性，对低新奇性进食（hyponeophagia）测试具有重要影响。当作者对海马体损伤大鼠和对照组大鼠进行低新奇性进食测试时，不慎将一只已测试的海马体损伤大鼠（此前已食用过甜玉米）放入了下一只待测对照组大鼠的笼中8。该对照组大鼠在14秒内即开始进食，是唯一一只进食潜伏期未达到300秒的对照动物。因此，在进行低新奇性进食测试时，必须格外注意防止此类食物气味的社会传递现象发生。
如果首次低进食行为测试未获得明确且无歧义的结果，可进行多次进一步测试。图1-4展示了不同实验装置的示例。可设计的测试情境数量仅受限于实验者的想象力。结果采用双因素重复测量方差分析（ANOVA）进行分析。由于低进食行为数据通常变异较大，不符合正态分布，常呈偏态分布，且部分动物的潜伏期极长，因此应首先对数据进行转换；平方根转换或对数转换特别适用于缩短极端长潜伏期的影响。
2. 仪器：
图1-4展示了食物新奇性厌食测试设置的示例。新颖食物与环境的具体组合并不关键，尽管图1所示的食物小孔显然最适合盛放液体，但也可在其内放置一小块甜玉米粒。
通常，最好用食物覆盖装置的大部分底面。这样做不仅是因为动物似乎对这种不寻常的表面产生厌恶反应，而且该方法还能消除在找到食物前因探索行为带来的干扰因素。例如，一种镇静药物可能看似具有致焦虑作用，实际上却是因为其抑制了动物的运动能力，从而延长了发现和进食食物的潜伏期，而非因其本身具有致焦虑效应。例如，有文献建议将食物放置在开放场的中央2。这种做法不仅会使进食潜伏期受到探索时间的干扰，还会引入另一个焦虑维度，即对开放场中央区域的回避行为——这是衡量开放场相关焦虑的经典指标，与自然栖息地中避免捕食风险的行为有关14。然而，在某些情况下，这可能反而是实验所期望的特征。文献2中描述的实验另一缺点是，诱饵为标准实验室饲料，置于开放场中央。这存在双重劣势：其一，该饲料并不新颖；其二，其适口性并非极佳，不像甜玉米或加糖炼乳等食物那样具有高度吸引力。我们始终发现，使用高度适口的诱饵不仅能增强动物在进食与回避新食物之间的冲突反应，还能减少实验前对动物进行过度禁食的需要，仅需轻度禁食即可。因此，本文所介绍方案的这一特点体现了Russell和Burch提出的“3R原则”中的“优化（Refinement）”原则20.
2.1 步骤：
禁食小鼠过夜。在测试前一晚移除笼中所有食物，然后每只小鼠给予1 g普通饲料，约为其正常食量的三分之一。若为群养，需确保饲料切分成小块，以便所有小鼠能均等摄食。次日早晨进行测试，并在测试一结束立即恢复喂食。
设置所选的低新物摄食试验装置，该装置也是一排小笼子，用于在测试前和测试期间将来自群养笼中的小鼠单独放置。这样可避免因逐步从群体中移除小鼠而导致群养笼中剩余小鼠焦虑水平升高（也可防止食物偏好在群体中的社会传递）。同时有助于在群养与单养动物之间实现测试的标准化，并确保动物处于最佳警觉状态。
将一只小鼠放入测试装置中。测量其开始进食的潜伏期，定义为持续进食或饮水2-3秒。通常小鼠最初会短暂嗅闻或舔舐食物，但随后才开始无抑制地持续进食。
也可以采取其他测量方法。例如，在固定时间段内（如开始喂食后的2分钟内）记录摄食时间，以及可能在此期间内消耗的食物量，均可进行测量。脑部损伤有时会不同程度地影响这些测量指标4。
2.2 使用图1所示装置进行低新物摄食测试的具体操作细节：
使用一个半透明的塑料壶（容积约1.5升，直径15厘米，壶嘴向外突出约2厘米）作为实验装置。以全脂加糖炼乳（雀巢Carnation品牌效果极佳）与水按1:1比例稀释（以便于操作）作为新食物。为将小鼠限制在底部并促进其对牛奶的探究，将塑料壶倒置，使壶嘴在食物井上方形成一个小凹槽。此设置可使小鼠的注意力集中于井内及牛奶，从而最大限度地减少可能影响小鼠对食物来源感知或定向能力的处理因素的干扰。
将小鼠头朝远离小孔的方向放置，并轻轻将水罐放至适当位置，注意不要夹住小鼠的尾巴。记录从小鼠被放入装置到开始正式饮水的时间延迟。仅嗅闻牛奶不计入饮水时间，必须持续饮水至少两秒钟才视为有效饮水。记录排泄的粪便颗粒数量，并注意是否发生排尿行为（但需注意，这些指标会受到在装置内停留时间的影响）。实验设定的截止时间为2分钟。若小鼠在此时间内未饮水，应将其从装置中移出，接着测试另外一至两只小鼠，约3分钟后重新测试先前未饮水的小鼠。这一间隔时间可能最有利于降低小鼠的焦虑水平，同时仍保持对装置的适应状态。可重复进行测试-休息-再测试-休息-再测试的循环，直至小鼠开始饮水或完成预设的试验次数。通常最多进行3次试验，即可使大多数小鼠开始饮水，同时避免实验时间过长。实验的检测参数为（累积）饮水潜伏期。
与其他可能受气味显著影响的实验一样，在开始测试前应先将非实验用小鼠放入装置中。在每只小鼠测试之间遵循标准化的清洁程序：清除尿液/粪便，先用湿润的布或纸巾擦拭食物井和塑料底座，再用干布或纸巾擦干。重新向食物井中添加牛奶（约 0.2 ml，加至井口边缘）。
<img src="/files/ftp_upload/2613/2613fig1.jpg" alt="实验室环境中用于液体测量的带体积刻度的量杯。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 图 1．一个改装过的塑料家用壶，用作低新物摄食行为测试装置。加糖炼乳可置于壶嘴内部的小型食物凹槽中，该设计能自然引导小鼠的注意力直接对准食物。壶底倒置后粘附的铅块可增加配重，防止小鼠触碰壶壁时导致装置移动。
<img src="/files/ftp_upload/2613/2613fig2.jpg" alt="水力平衡概念；开放式顶部箱装置；液体水平均衡演示。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 一个观察室，内含两个白色（引发焦虑的）白色插入物，用于新物体进食抑制测试。甜玉米可用作新食物。
<img src="/files/ftp_upload/2613/2613fig3.jpg" alt="啮齿类动物行为实验装置；围栏中的小鼠进食食物以进行观察研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 另一个恐新厌食测试装置。新食物为猴用零食混合物。
<img src="/files/ftp_upload/2613/2613fig4.jpg" alt="小鼠行为实验示意图；实验室中动物测试迷宫及观察装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 另一种新物体进食抑制测试装置。所提供的食物为混合切碎的坚果。
3. 进行多次低进食量实验：
首次新物体进食抑制测试可能无法提供明确的结果。这种情况经常发生，通常是由于基线（对照）值过高或过低，导致出现天花板效应或地板效应。在测试海马体损伤小鼠时曾遇到过地板效应10；似乎必须有足够的高对照值才能观察到新物体进食抑制的减少。
判断测试环境所需的厌恶程度可能较为困难。如果小鼠已经接受过多次测试（不一定是与焦虑相关的任务），其情绪反应水平将低于初次接受行为测试的小鼠，因此需要采用更具焦虑诱导性的测试环境。这通常可通过高架测试装置（如图4所示）来实现。此外，可在测试环境中增加厌恶性噪音，例如开启音量较大的收音机或白噪音发生器。更明亮的光照条件也可增强测试环境的厌恶性。
因此，如果首次的新物体进食抑制实验结果不显著，可尝试多种其他测试情境，并进行重复测量方差分析。这是一种非常高效的实验设计。
4. 预期结果：
海马体损伤会导致小鼠新物体恐避行为显著降低10，近期未发表的研究表明，与大鼠类似1，这一效应源于海马体的腹侧区域。缺乏KATP通道亚基Kir6.2的小鼠在一项测试中表现出更强的新物体恐避行为，但在另一项测试中则减弱9，这一结果看似矛盾，但突显了测试环境的差异可能对结果产生显著影响，同时也说明进行多种测试的重要性。129S2/SvHsd小鼠的新物体恐避行为强于C57BL/6JolaHsd小鼠6。事实上，对多种近交系小鼠品系的比较显示，不同品系之间存在显著的差异21。

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未声明任何利益冲突。

在新奇进食抑制测试中，潜伏期数据通常变异较大。本文所述方法是为动物设定固定的进食时间段，若其未能进食，则在之后重新测试，该方法有助于最大限度地减少超长潜伏期的风险，并节省实验者的时间。
与高架十字迷宫等焦虑测试相比，嗜低新物性（hyponeophagia）的一个优势在于，如果首次测试结果未能达到统计学显著性，可以使用不同的新颖测试环境和食物再次进行测试，因为所测量的焦虑类型似乎相同，并不会因先前进行的测试而发生本质改变，这一点与高架十字迷宫不同16。随后可采用重复测量方差分析（ANOVA）来评估该系列测试结果。
目前人们已知，“焦虑”这一统称涵盖了情绪性的多个不同方面11,15,18。在新奇抑制进食（hyponeophagia）中表现出变化的小鼠，未必会在开阔场地、高架十字迷宫或明暗箱实验中表现出相应变化。因此，这些行为测试背后所涉及的脑系统至少在一定程度上是不同的。例如，下丘脑和杏仁核很可能参与了新奇抑制进食行为，因为它们（在多种功能中）与摄食行为的调控密切相关。

低新奇食量：小鼠焦虑行为的检测指标

Hyponeophagia: A Measure of Anxiety in the Mouse

在当今之前，当α-氯醛糖等速效强效灭鼠剂尚未投入使用时，害虫防治工作常受到一种称为“诱饵厌避”现象的阻碍。由于胃部贲门括约肌较为紧闭，小鼠和大鼠无法呕吐，因此为了应对食物可能具有毒性的风险，它们进化出一种策略：首先仅摄入极少量的新物质，随后逐渐增加摄入量，直到动物确定该物质是否安全且有营养。因此，过去的捕鼠人会先在鼠患区域放置一种适口性良好的物质（例如燕麦片），作为毒素的载体。只有当动物已开始大量取食该载体时，他们才会加入毒药，并精确控制用量，以确保不会影响载体的口感。此时，动物已大量取食这种有毒诱饵，毒剂便会迅速发挥作用。
诱饵回避现已被行为学实验室用作衡量焦虑的一种方法。在新的环境（例如新笼子）中，向小鼠（或大鼠）提供一种适口性高但陌生的物质，如甜玉米、坚果或甜炼乳。随后测量动物摄取一定量这种新食物所需的时间（摄食潜伏期）。
Robert M.J. Deacon 的联系方式为 <a href="mailto:robert.deacon@psy.ox.ac.uk">robert.deacon@psy.ox.ac.uk</a>

由于小鼠和大鼠天生具有警惕性，在陌生环境中初次接触新食物时，其摄食行为通常较缓慢。这种新物体进食减少现象在实验室条件下易于测量，尽管实验室动物的焦虑程度远低于其野生同类。

在当今速效强效灭鼠剂（如α-氯醛糖）尚未问世之前，害虫防治人员的工作常常……

本实验的总体目标是观察焦虑体验。当小鼠在新环境中接触到一种新食物时，首先选择一种适口性很高的食物，然后选择动物将在此体验该食物的新环境。制备完成后，引入动物并记录行为参数。最终可获得结果，通过进食潜伏期的变化来反映焦虑水平的改变。在阅读暴食症相关文献时，我发现人们常使用非常大的实验区域放置食物以诱发焦虑情绪。但你可以使用小得多的测试区域来诱发焦虑。这样做的结果是，你的暴食潜伏期数据不会被大量的探索性活动所干扰。此外，如果你正在测试的化合物或造成的损伤会降低运动活性，那么这也将成为一个混杂因素，而在较大的测试区域中，这种干扰会更加明显。但较小的测试区域将确保小鼠即使移动非常缓慢，也能相对较快地找到食物。这些测试的核心目的是让小鼠进入测试装置后几乎立即发现食物，从而获得纯粹的摄食过度潜伏期数据。测试前一晚，从饲养笼中移除所有食物，每只小鼠仅保留一克饲料。将饲料块分开，以确保群养动物能够摄取均等的份额。接下来，选择要使用的摄食过度测试装置类型。已开发出四种类型，它们之间存在细微差异。重要的是，应将干燥诱饵均匀分布在装置底部，以减少动物探索的需要。在此示例中，液体诱饵置于食物井内。适口性极强的诱饵可促进对新食物的品尝行为，且仅需轻微的食物剥夺。以下是可用作诱饵的适口性食物示例，用于设置实验装置。用胶水将一个铅块粘在直径约15厘米、带有突出约2厘米壶嘴的半透明塑料壶底部，然后将壶倒扣在白色塑料底座上，使S形壶嘴覆盖一个食物孔。由于气味在此测试中可能起重要作用，应在测试开始前让非实验小鼠先探索该装置。接下来，排列一排小笼子。在测试前约五分钟，将每只小鼠放入一个笼子中，并在每次测试后将其放回相同的笼子。每次试验后，在食槽中加入全脂加糖炼乳，与水按1:1比例稀释，作为诱饵。开始测试时，将小鼠放置在平台上，使其背向小孔。轻轻将烧杯放入指定位置，注意不要夹住小鼠的尾巴。测量进食潜伏期。进食潜伏期定义为持续进食或饮水。持续观察 2 到 3 秒，计数任何排出的粪便颗粒，并记录是否排尿。两分钟后移走动物。如果小鼠尚未醉酒，则将其放回笼中，并在约三分钟后重新测试。大多数动物在下一次试验前的三次试验内会饮酒。用湿布彻底清洁食槽和塑料底座，再用干布擦干，并重新填满食槽。海马体损伤会导致小鼠摄食过度显著减少。在摄食过度测试中，潜伏期数据通常具有高度变异性。该直方图显示了一组小鼠连续三次暴食测试的数据。按照此操作流程，可对动物进行不同的焦虑测试，例如明暗箱或十字迷宫。然而，目前我们了解到焦虑具有多种不同的表现形式，与食物相关的焦虑可能并不等同于明暗箱或十字迷宫中所测量的焦虑。因此，我们应始终在全部三种焦虑测试中，或尽可能多的测试中，对给予小鼠的任何治疗方法进行检验，以确保该化合物进入临床应用时，在人体中更有可能发挥抗焦虑作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

Hyponeophagia：在小鼠的焦虑测量

高架十字迷宫实验是测量小鼠焦虑样行为最常用的实验方法之一。本文展示了一段视频，详细演示了该实验的操作流程。...

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十字迷宫用于测量啮齿类动物的类焦虑行为。该装置包含两条相对的封闭臂和两条相对的开放臂，焦虑的啮齿类动物会回避开放臂。中央区域既非完全开放也非完全封闭，因此在此区域停留的时间具有模糊性，难以解释。本文介绍了一种改进的十字迷宫方案，消除了这一中央区域。...

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利用旷场迷宫检测小鼠的运动能力和焦虑样行为

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使用全身麻醉的小鼠程序中系统性评估其健康状况

当小鼠单独饲养并配备跑轮，同时限制其食物获取时，会出现食物摄入量减少和跑轮活动增加的现象。这一实验现象被称为活动性厌食症。该范式为研究神经性厌食症相关神经生物学机制和行为特征提供了实验工具。...

评估小鼠的活动性厌食症

本文介绍了小鼠中不可预测的慢性温和应激方案。该方案可诱导长期的类抑郁表型，并可用于评估潜在抗抑郁药物在逆转行为学及神经分子水平类抑郁缺陷方面的有效性。...

小鼠快感缺失诱导的不可预测性慢性轻度应激方案

通过光遗传学手段操控特定的神经元群体或脑区，可在自由活动的动物中以高时空分辨率调控其行为。结合不同类型的光遗传学工具与慢性植入的光纤，可实现多种神经调控及行为学检测。...

光遗传学操控神经元活动以调节自由活动小鼠的行为

啮齿类动物无法报告偏头痛症状。在此，我们描述了一种可操作的实验范式（明/暗箱和开放旷场实验），用于测量畏光现象，这是偏头痛患者中最常见且最令人困扰的症状之一。...

利用小鼠畏光行为研究偏头痛样症状

通过间歇性给予小鼠M&amp;M's（一种由脂肪和糖组成的高适口性食物）建立了暴食模型。与持续获得或未获得该食物的小鼠相比，间歇性获得这种高脂高糖食物的小鼠表现出类似应激的行为、摄取更多热量，并且更偏好该食物而非标准饲料。...

小鼠间歇性暴食摄入模型

本文介绍了一种嗅觉偏好测试方案，可用于评估抑郁小鼠模型对具有吸引力和厌恶性气味刺激的负面嗅觉偏向。...

一种用于测量抑郁小鼠模型中嗅觉享乐偏好的嗅觉偏好测试

学习使用小鼠新奇食物抑制实验测量焦虑水平的方法。通过记录进食潜伏期评估焦虑反应，采用小型测试场地减少探索行为干扰。该方法为神经科学研究提供了可靠的焦虑行为学评估工具。

低新奇食量：小鼠焦虑行为的检测指标

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