Name: 前初级人类输卵管上皮细胞的体外培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 学习人类输卵管上皮细胞的体外培养方法，用于研究高级别浆液性卵巢癌的起源机制。该技术可保留分泌细胞和纤毛细胞的正常形态与生理功能，为肿瘤发生研究提供可靠的细胞模型。

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我们感谢布莱根妇女医院病理科的教职员工、研究员、住院医师和医师助理为这些研究提供了可用的组织样本。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（P50 CA105009、K08 CA108748、U01 CA152990）、卵巢癌研究基金、May Kay基金会、诺华制药公司、Robert和Deborah First基金、Randi和Joel Cutler卵巢癌研究基金、Marsha Rivkin基金会-科学学者奖、美国癌症研究协会（AACR）- George和Patricia Sehl癌症遗传学研究奖学金，以及美国医师以色列医学研究奖学金 - Claire和Emmanuel G. Rosenblatt基金会资助项目的资助。

1. 胶原蛋白制备与滤膜包被。
<ol>
	<li>制备人胎盘胶原蛋白时，用镊子取30 mg人胎盘胶原蛋白，置于500 ml烧杯中，加入50 ml蒸馏水（dH2O），并放入搅拌子。</li>
	<li>直接向胶原蛋白中加入100 μl冰醋酸，以促进其溶解。将溶液加热至37°C，并持续搅拌使其溶解，通常在20–30分钟内完成。若溶液中仍有胶原蛋白纤维残留，将影响后续过滤除菌操作。</li>
	<li>将50 ml胶原蛋白原液用450 ml dH2O稀释，然后使用0.2 μm滤膜进行过滤除菌。此即为最终工作液，于4°C保存备用。</li>
	<li>通过在Transwell滤膜上包被胶原蛋白（50–100 μl）过夜来制备滤膜。冷藏的胶原蛋白需先恢复至室温，再加入Transwell上室，使其在室温下覆盖滤膜过夜。在将解离的原代输卵管（FT）上皮细胞（见下文）接种到Transwell滤膜之前，至少在使用前1小时，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗滤膜三次，以去除多余的胶原蛋白。</li>
</ol>
2. 组织采集与解离。
<ol>
<li>新鲜的输卵管（FT）伞部应在无菌的1×PBS中收集于50 ml离心管中，并在冰上保存，随后尽快于无菌组织培养罩内进行处理。</li>
	<li>用20 ml预冷的1×PBS清洗组织样本一次（若样本采集于其他类型的培养基中或带有血液，需至少清洗3次，以尽可能去除血液及外源培养基，因其可能影响接种效率）。</li>
	<li>用无菌镊子将输卵管转移至含有少量PBS的10 cm组织培养皿中，使用无菌手术刀和无菌镊子沿纵向切开，以最大程度暴露上皮细胞。将伞部展开，使其不再呈管状，而成为近乎扁平的组织片，然后切成较小但仍可回收的组织块（直径约3 mm）。</li>
	<li>将组织块转移至50 ml离心管中，加入45 ml预冷的解离液（MEM，含1.4 mg/ml Pronase和0.1 mg/ml DNAse）。</li>
	<li>在4°C下轻轻摇动孵育24至72小时（根据经验，48小时为最佳）。为检测解离程度，取一滴解离液置于载玻片上，观察细胞聚集情况及组织活性（如纤毛细胞的摆动）。理想状态下应同时观察到单个细胞和少量小细胞团。</li>
</ol>
3. 输卵管铺板。
<ol>
<li>当上皮细胞解离程度达到最佳时，加入10%体积的胎牛血清（FBS）以灭活培养基。轻轻颠倒数次，使细胞悬液分散成更小的细胞团块。</li>
	<li>让较大的组织团块（间质组织）在离心管底部沉降。将含有上皮细胞的上清液转移至第二个50 ml离心管中。</li>
	<li>向原始的50 ml离心管中加入50 ml冷的不含FBS的MEM培养基。轻轻颠倒以收集残留细胞。将上清液收集至第三个50 ml离心管中（若样本量较大且预期细胞数量较多，可重复此步骤以最大化细胞回收）。此时可丢弃较大的间质/细胞外组织碎片。现在您已获得两个50 ml离心管的细胞悬液。在1000 rpm下离心5分钟，并吸除上清液中的解离培养基。</li>
	<li>用约5–10 ml预热至37°C的USG培养基（DMEM:F12补充2% USG和1%青霉素-链霉素）重悬细胞沉淀。轻柔吹打混匀。注意避免剧烈吹打，以免损伤上皮细胞，影响培养质量。此时应可见单个细胞及小团块（见图1）。</li>
	<li>将细胞悬液转移至Primaria培养皿中，孵育至少1小时，最长可达3小时。成纤维细胞和红细胞会贴附于塑料表面，而输卵管上皮细胞则不会贴壁。1小时后观察培养皿，查看是否有细胞贴附。通过观察纤毛的摆动可确认纤毛细胞的存在。</li>
	<li>在孵育期间，可对胶原包被的滤膜进行清洗并做好细胞接种准备（见步骤1.4）。</li>
	<li>在Primaria培养皿中孵育1–3小时后，将细胞悬液转移至15 ml离心管中，并用5 ml USG培养基冲洗Primaria培养皿，将冲洗液也转移至该离心管，使最终体积为15 ml。在1000 rpm下离心5分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。根据沉淀量，用适量USG培养基重悬细胞（通常为1–3 ml）。初始重悬体积宜偏小，以便后续需要时可进一步稀释。轻柔吹打重悬。</li>
	<li>取10 μl重悬的细胞悬液加入血细胞计数板，测定细胞密度。提示：应识别具有明显深色细胞膜且非柱状的上皮细胞。也可计数明显运动的纤毛细胞。呈晕轮状的小细胞为红细胞，不应计入。由于存在一定细胞团块，需在计数时加以估算。接种目标为每张滤膜1.65 × 105个细胞，或至少达到75%滤膜覆盖（见图1）。若细胞接种过稀，将无法形成完整的上皮层。</li>
	<li>向24孔板每孔底部加入500 μl USG培养基，插入Transwell小室。随后将所需体积的输卵管细胞悬液（见上文）加入每张滤膜上表面，通常为100 μl。</li>
	<li>孵育1–2天，期间勿扰动滤膜上表面。若有必要，可在这些天内更换基底侧培养基。1–2天后，可小心用USG培养基冲洗上表面，并在滤膜上表面加入少量培养基（50–100 μl）。在显微镜观察前，若将滤膜顶端侧的培养基移除，将更易于判断细胞融合度。下室必须始终含有培养基。当培养物完全融合（通常在5天内）后，从基底侧向上表面通过滤膜迁移的培养基量应可忽略不计。</li>
	<li>前10天内每两天更换一次基底侧培养基。下室必须始终含有培养基以维持细胞存活。一旦细胞形成致密的上皮层（见图1和图2），即可用于后续实验，如免疫荧光（IF）或免疫组织化学（IHC）。</li>
</ol>
4. 膜处理。
<ol>
<li>膜的处理方式取决于后续实验的类型，但通常包括从Transwell小室中取出滤膜。</li>
	<li>取出前，通常需用200 μl的1× PBS将滤膜清洗3次。</li>
	<li>吸去滤膜顶端和基底侧的PBS。此操作应逐孔进行，以防止膜干燥。</li>
	<li>将小室从板中取出，翻转至底部朝上，使用无菌手术刀沿膜边缘切割。建议沿膜边缘直线切割，尽量完整地取下膜，避免拖动刀片沿边缘划动。</li>
	<li>使用镊子将滤膜从小室中取出，并记录细胞所在的一侧。随后可根据需要对滤膜进行免疫荧光（IF）、免疫组化（IHC）等处理。</li>
	<li>示例：进行免疫荧光实验时，滤膜经固定、通透、封闭及按标准免疫荧光流程与相应抗体孵育后，应将滤膜置于载玻片上，细胞面朝上，滴加含DAPI的Vectashield封片剂，再加盖玻璃盖玻片。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
Transwell 小室可轻松取出以进行检查 离体 通过免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）对上皮细胞进行检测。利用细胞谱系特异性标记物，可对这些培养物中的分泌型细胞（Pax8阳性）和纤毛细胞（Sall2阳性）区室进行成像与定量分析（图3）。此外，利用这些标记物，可监测各类细胞对不同生理信号刺激的响应情况 10该系统已被用于表征输卵管上皮细胞在不同刺激条件下分泌组和细胞内磷酸化蛋白质组的变化。
<img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig1.jpg" alt="组织培养流程图；细胞解离、孵育及显微镜观察用于细胞分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. 示意图展示如何 离体 从原代人输卵管组织中生成培养物。 从手术室获取输卵管伞部组织，切碎后制成小片段 1 经洗涤后，在解离培养基中孵育24-72小时 2组织解离完成后，让组织碎片沉降至孵育管底部，收集含有解离上皮细胞的培养基 3可通过相差显微镜观察来监测解离效率 4将解离的上皮细胞接种于Primaria培养板中培养，以去除不可避免混杂在上皮细胞中的成纤维细胞和造血细胞 5. 非上皮细胞被充分去除后，将上皮细胞接种至涂有 人胎盘胶原 的 transwell 滤膜上 5培养基通过下方的transwell以扩散方式提供。培养物孵育24-48小时后，移除顶端培养基。 离体 培养物随后培养5-8天，以在Transwell滤膜上形成完整、连续的细胞单层。 离体 培养物在此状态下可保持活性长达4周。示意图 5 显示完全成熟的示意图 离体 培养示例：从嵌插物中取出的滤膜经苏木精-伊红（H&E）染色&amp;E）以展示极性与结构的 离体 上皮组织
<img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig2.jpg" alt="在2倍、10倍、20倍放大倍数下观察到的细胞分裂阶段；显微镜下的细胞观察与分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
 图2. FT ex vivo 培养物的明场显微镜图像。 Transwell 小室包被有人源胎盘胶原蛋白，可见0.4μm孔径（a）。FT上皮细胞培养于胶原蛋白包被的小室上（b），并形成一层上皮细胞层（c）。在上皮细胞培养中，通常可见少量碎片附着于细胞表面（箭头所示），尤以纤毛细胞更为常见。
<img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig3.jpg" alt="免疫荧光显微镜显示细胞核中 PAX8、FOXJ1、SALL2 的表达，合并图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
 图3. FT 离体 培养免疫荧光（IF） IF图像示例 离体 使用针对（a）分泌细胞（Pax8）和（d）纤毛细胞（Sall2）标志物的抗体对培养细胞进行固定和染色。DAPI用于细胞核定位的对照（蓝色，b 和 e），并展示了抗体与DAPI染色的合并图像（c 和 f）。细胞数量取决于细胞培养时间的长短（Pax8染色，7天；Sall2染色，3天）。

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</ol>

Drapkin 博士担任诺华制药公司的顾问。其他作者均声明不存在任何潜在利益冲突。

将输卵管峡部（FT）确定为浆液性卵巢癌（SOC）的候选起源部位，为开展基础和转化研究提供了契机，旨在解析已知风险因素与实际浆液性癌变过程之间的关联机制。实现这一目标的关键在于建立可操作的模型系统，以帮助我们开始验证输卵管上皮细胞（FTSEC）是盆腔浆液性癌起源细胞的假说。本文所述的离体（ex vivo）培养模型是一种新型系统，能够以保持输卵管原代上皮形态和生物学特性的条件，分离并共培养输卵管的原代分泌细胞和纤毛细胞。利用该系统，我们近期表征了该上皮的分泌组及其对机械性和基因毒性损伤的响应方式10。排卵是与卵巢肿瘤发生密切相关的主要风险因素，其特征表现为组织损伤、炎性介质、生长因子和激素的共同作用11。该系统可用于研究排卵微环境对分泌细胞和纤毛细胞反应性及存活能力的影响。此外，还可通过该系统评估其他细胞类型（如炎性细胞）的作用，从而更深入地理解驱动细胞类型分化以及促进这些细胞发生肿瘤转化的因素。类似模型已在存在极化上皮的其他组织中建立。例如，在气道极化原代上皮培养模型中，已有研究评估了异源表皮生长因子（heregulin）对细胞增殖及细胞损伤反应的影响12。此类模型系统为研究起源于上皮组织的肿瘤的起始和发病机制提供了新颖且有效的手段，尤其在输卵管这类目前尚无可用细胞系、且迫切需要明确关键信号通路并开发新型治疗策略的组织中，具有至关重要的意义。

<table><tbody><tr><td>人胎盘来源的胶原蛋白（Bornstein 和 Traub IV 型）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12 培养基</td><td>Cellgro</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser G</td><td>Crescent Chemical Company</td><td>67042</td><td>向浓缩液瓶中加入 20 ml DMEM:F12，每 500 ml 培养基中加入 10 ml（终浓度为 2%）</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen Strep）</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>BD Primaria 培养板</td><td>BD Biosciences</td><td>353802</td><td></td></tr><tr><td>24 孔 Transwell 可渗透支持膜</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>透明，6.5 mm 插入物，0.4 &amp;#x03BC;m 孔径，经处理的聚酯膜</td></tr><tr><td>MEM（最低必需培养基）</td><td>Cellgro</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche Group</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Sall2 抗体</td><td>Harvard - T. Benjamin 实验室</td><td>赠送</td><td>1:20 稀释</td></tr><tr><td>Pax8 抗体</td><td>Proteintech</td><td>10336-1-AP</td><td>1:1000 稀释</td></tr></tbody></table>

离体 原代人输卵管上皮细胞的培养

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

上皮性卵巢癌是美国女性癌症死亡的主要原因。与其他女性特异性癌症（如乳腺癌和子宫癌）不同，近年来这些癌症的死亡率有所下降，而过去二十年中卵巢癌的治愈率却基本保持不变1。这主要是由于缺乏合适的早期筛查工具，无法在疾病早期阶段（此时手术和化疗最为有效）进行检测2, 3。因此，大多数患者就诊时已处于晚期，并伴有广泛的腹腔受累。此外，卵巢癌是一种具有多种组织学亚型的异质性疾病，进一步增加了诊疗复杂性4, 5。其中，浆液性卵巢癌（SOC）是最常见且最具侵袭性的亚型，通常与BRCA基因突变相关。目前该领域的实验模型主要依赖于癌细胞系和小鼠模型，以更深入地理解疾病发生的遗传起始事件及发病机制6, 7。近年来，输卵管被提出为SOC的新起源部位，输卵管分泌性上皮细胞（FTSEC）被认为是其可能的起源细胞8, 9。然而，目前尚无可用的细胞系或培养系统用于研究输卵管上皮或FTSEC。本文中，我们描述了一种新型的ex vivo培养系统，可在体外培养原代人输卵管上皮细胞，并维持其组织结构、极性、免疫表型以及对生理性和基因毒性应激的反应能力。该ex vivo模型为研究SOC提供了有力工具，有助于更深入理解肿瘤如何从该组织发生，以及肿瘤起始与进展的相关机制。

输卵管（FT）被认为是浆液性卵巢癌（SOC）的另一个起源部位。本方案描述了一种用于分离和培养输卵管上皮细胞的新型方法。 离体 输卵管上皮细胞的培养。该系统可重现 体内 上皮组织，并允许对SOC发病机制进行研究。

上皮性卵巢癌是美国女性癌症死亡的主要原因之一。与其他女性特异性癌症（如乳腺癌和……）相比，……

卵巢癌仍是一种致死率极高的疾病，其临床表现多样，组织学亚型繁多，并伴有广泛的遗传异常。浆液性卵巢癌是最常见且最具侵袭性的亚型，近期研究表明，其中相当一部分肿瘤起源于输卵管而非卵巢。本实验的目的是建立人输卵管细胞的离体培养体系，使分泌细胞和纤毛细胞能够在保持其正常形态、极性及生理特性的情况下实现共培养。首先收集新鲜的人类输卵管组织样本，并将其解剖成较小的组织块。然后将上皮细胞从输卵管组织的间质中分离出来。接着分离输卵管上皮细胞，并从培养物中去除其他类型的细胞。最后一步是将输卵管上皮细胞接种到胶原蛋白包被的滤膜上，并进行共培养。最终可通过免疫荧光显微镜或免疫组织化学方法获得结果，显示培养物中同时存在输卵管分泌细胞和纤毛细胞。该技术相较于现有方法（如使用卵巢癌细胞系）的主要优势在于，可在一种体外共培养体系中同时研究两种类型的输卵管上皮细胞，且该体系能够保持正常人输卵管上皮的形态结构和细胞极性。在培养人输卵管上皮细胞之前，必须制备胶原蛋白包被的Transwell小室，作为上皮细胞培养的基质。首先，将30毫克人胎盘胶原蛋白转移至含有50毫升蒸馏水和一个磁力搅拌子的BCO中。然后将100微升冰醋酸直接移液至胶原蛋白上。将烧杯置于搅拌加热板上，边搅拌边将溶液加热至37摄氏度，持续加热搅拌20至30分钟。确保胶原蛋白完全溶解，无任何胶原蛋白纤维残留。胶原蛋白溶解后，加入450毫升蒸馏水，然后在组织培养罩内操作，通过0.2微米滤膜过滤除菌。将溶液转移至50毫升离心管中。制备胶原包被的Transwell小室滤膜时，先用镊子将滤膜放入24孔板的孔中，然后在Transwell滤膜上表面加入50至100微升胶原溶液，于室温孵育过夜。收集后，剩余的胶原蛋白溶液可在4°C下保存。将新鲜的输卵管伞部组织置于无菌PBS中，放入50毫升离心管内，并立即置于组织培养罩内的冰上。用移液器将20毫升预冷的PBS加入管中。为清洗组织，小心吸除PBS，避免扰动组织，并重复洗涤两次。如果组织被血液污染，使用无菌镊子将组织转移至无菌的10厘米组织培养皿中。然后用无菌镊子夹住一条输卵管纤毛组织，使用带有无菌刀片的手术刀沿纵轴切开纤毛组织，以最大程度暴露上皮细胞。用镊子将切开的组织展开，直至几乎呈扁平片状，再将其切成直径约三毫米的小片。使用镊子将组织块转移至含有 45 毫升预冷解离液的 50 毫升离心管中。将离心管置于摇床上，在 4°C 下轻轻摇动孵育 24 至 72 小时。有关判断最佳解离程度的操作步骤，请参见书面实验方案。通过观察跳动的纤毛细胞来评估组织活性及团块形成程度。在达到最佳解离效果后，应可见单个细胞以及少量小团块。通过加入五毫升胎牛血清（FBS）以灭活蛋白酶（pronase）。然后将离心管倒置两到三次，使细胞团块分散成较小的聚集体。将离心管在室温下静置一到两分钟，使较大的基质组织团块沉降至管底。随后，在不扰动较大组织碎片的情况下，使用血清移液管吸取含有上皮细胞的培养基，并转移至一支干净的50毫升离心管中。将50毫升不含FBS的冷MEM加入含有组织残余物的50毫升离心管中。倒置混匀以收集残留的上皮细胞，然后静置使较大的团块沉淀。再次小心收集上清液，避免扰动较大的组织团块，并转移至一个新的50毫升离心管中。将两管上皮细胞悬液均在1000 ×g条件下离心5分钟。离心结束后，吸除上清液并弃去。接下来，Reese 将两个细胞沉淀物用五毫升预热至 37 摄氏度的 USG 培养基轻轻吹打重悬。然后将细胞悬液转移至培养皿中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳的组织培养孵箱中孵育一至三小时，以去除上皮细胞悬液中的成纤维细胞和红细胞。在孵育期间，用 100 微升 PBS 清洗胶原包被的滤膜，以去除多余的胶原。必须避免触碰膜，因为任何损伤都可能影响输卵管离体培养的质量。孵育时间结束后，将细胞悬液转移至15毫升离心管中。随后用5毫升USG培养基冲洗培养板，并将此溶液加入15毫升离心管中。随后，将细胞悬液以每分钟1000转的速度离心5分钟。离心后，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。根据沉淀的大小，将沉淀重悬于1至3毫升的USG培养基中。使用血细胞计数板对10微升细胞悬液中的上皮细胞和纤毛细胞进行计数。上皮细胞呈非柱状，细胞膜明显较深；活的纤毛细胞可见运动。细胞计数后，排除红细胞的计数。加入足够的培养基，将上皮细胞稀释至每100升含1.65 × 10⁵个细胞。接种细胞时，先用移液器将500 µL USG培养基加入24孔板的各孔中。随后将经胶原蛋白包被的Transwell小室放入各孔，再在胶原蛋白包被的Transwell插入式培养小室上方加入100 µL细胞悬液，将含有细胞的培养板置于组织培养孵箱中孵育48小时。此后，用 USG 培养基小心冲洗小室的顶端，并用移液器在膜表面加入 50 至 100 微升培养基。接着，吸除滤膜基底侧的培养基。插入小室并更换新鲜的 USG 培养基。然后将培养板放回组织培养孵育箱中。在培养期间，每两天更换一次基础培养基。当培养物达到特定应用所需的汇合度时。吸出孔中的基础培养基，用 200 微升 PBS 轻轻洗涤细胞培养物。重复洗涤两次。最后在孔中保留 PBS 的终末体积。逐一处理膜。首先从单个孔中吸去 PBS，然后用镊子取出 transwell 膜插件，并将插件倒置。接下来，使用无菌手术刀在膜的边缘进行直线切割。然后用镊子将膜完整地从插入物中取出。随后可根据所需应用的标准操作流程对滤膜进行处理。这张10倍放大倍率下拍摄的明场图像显示了胶原蛋白包被后Transwell膜的表面；另一张10倍放大倍率下拍摄的图像显示了在胶原蛋白包被的插入式培养小室中培养的输卵管上皮细胞，这些细胞形成了上皮层。箭头指示可能存在附着于纤毛细胞的细胞碎片。这张20倍放大倍率下拍摄的视野图像展示了体外培养中健康的输卵管上皮细胞层。这幅荧光显微镜图像显示了使用抗 PAX8 抗体对输卵管上皮细胞培养物进行的免疫荧光染色，PAX8 是分泌细胞的标志物，呈红色，以及 dpi，一种细胞核标志物，呈蓝色。在此合并图像中，PAX8 与 dpi 的信号可见重叠。该图像展示了使用抗细胞抗体对输卵管上皮细胞培养物进行的免疫荧光染色结果。红色显示纤毛细胞的标志物Two，蓝色显示细胞核标志物dpi。在此发育阶段后的融合图像中，可见Two和DPI信号存在重叠。该技术为卵巢癌领域的研究人员探索输卵管作为浆液性卵巢癌新型起源位点的作用铺平了道路。

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科研

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生物学

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由小鼠输卵管上皮细胞建立类器官系用于高级别浆液性卵巢癌建模

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离体原代人输卵管上皮细胞的培养

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离体 原代人输卵管上皮细胞的培养

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