腹膜低密度中性粒细胞分离:一种使用磁激活细胞分选从腹膜灌洗液中获得低密度中性粒细胞的技术

低密度中性粒细胞 （LDN） 是一种独特的中性粒细胞亚群，在胃肠道癌等病理条件下数量增加。LDN 可以从患者的腹膜腔冲洗液或灌洗液中分离出来。

首先，过滤灌洗液以去除组织碎片。离心滤液以获得含有血细胞（包括LDN）的沉淀。将其重悬于合适的缓冲液中。将该悬浮液层层在最适合LDN分离的合适密度梯度介质上。

心机根据不同的血液成分的相对密度分离它们。较致密的红细胞形成底层，而密度最小的血浆部分形成最顶层。密度较低的 LDN 与其他单核细胞一起占据中间层。

中间层转移到含有封闭试剂的新鲜管中。试剂组分可阻断所有非靶细胞表面的非特异性结合位点，并在后续标记过程中提高 LDN 的特异性。

添加靶向在LDN上过表达的特定细胞表面分子的抗体偶联微珠。孵育抗体-珠复合物与LDN上的靶分子结合。

孵育的悬浮液通过放置在磁场中的色谱柱。在磁影响下，所有LDN-微珠复合物都粘附在柱壁上，而未标记的细胞通过。

移除色谱柱。使用合适的缓冲液冲洗内容物以洗脱并收集含LDN的馏分。

获取中性粒细胞，首先，在伤口闭合前立即将 1 升生理盐水直接输入刚因胃肠道恶性肿瘤接受腹部手术的患者的腹腔内，并广泛灌洗腹腔至少 1 分钟。然后，搅拌腔内的生理盐水，并用四个 50 毫升注射器回收 200 毫升灌洗液。

在实验室中，将腹膜灌洗液通过 100 微米尼龙过滤器转移到单独的 50 毫升管中进行离心。将沉淀重悬于补充有0.02%EDTA的5毫升PBS中，并小心地将每个细胞悬液覆盖在3毫升密度梯度溶液上。密度梯度分离后，从每管中收获2至3毫升中间层，并在每管10毫升新鲜PBS加EDTA中洗涤腹膜液样品。将沉淀倒入 10 毫升新鲜 PBS 加 EDTA 中进行额外洗涤，并将细胞稀释至每 60 微米磁活化细胞分选 （MACS） 缓冲液浓度的 1 倍 10 至第七个细胞。

在4摄氏度下用20微升Fc阻断任何非特异性结合10分钟，然后加入20微升抗CD66b磁珠。在4摄氏度下10分钟后，将细胞洗涤并重悬于500微升MACS缓冲液中，并将细胞添加到合适的磁分离器的磁场中适当大小的磁柱中。当所有 CD66b 阴性细胞都通过色谱柱后，向色谱柱储液器中加入 15 毫升新鲜 MACS 缓冲液，并将色谱柱从磁分离器转移到新的锥形管中。然后，立即插入色谱柱，将磁标记的 CD66b 阳性冲洗到试管中。

• Low-density neutrophils (LDNs) - A distinct neutrophil subpopulation increased in pathological conditions.
• Ficoll-Paque Plus protocol - Method for isolating neutrophils using density gradient separation.
• Peritoneal lavage procedure - Technique for washing and collecting fluid from the peritoneal cavity.
• Magnetic cell sorting (Miltenyi Biotec) - Technique to selectively isolate specific cells using magnetic microbeads.
• CD66b - A surface molecule overexpressed on LDNs, useful for their identification and isolation.

• Intrduce LDNs – Subtype of neutrophil prevalent in diseases like cancer (e.g., low density neutrophils).
• Outline Ficoll-Paque Plus protocol – Method for cell separation based on density (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Explain Peritoneal lavage procedure – Technique to collect cells from the peritoneal cavity (e.g., peritoneal lavage procedure).
• Connect to Magnetic cell Sorting – Isolation of LDNs using magnetic microbeads and specific markers (e.g., CD66b).

• What are low-density neutrophils and how to identify them using peritoneal lavage procedure?
• How does Ficoll-Paque Plus protocol help in separating LDNs?
• How does magnetic cell sorting with CD66b microbeads isolate LDNs?

• Practical Applications – Isolation of LDNs for clinical and research purposes (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Industry Impact – Advances in cell isolation techniques benefitting biomedical sector (e.g., magnetic cell sorting).
• Societal Importance – Improved understanding and treatment of certain diseases (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements – Automatic isolation of specific cells aiding in research studies.