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癌症研究
0 次观看 • 4:59 分钟 • April 30th, 2023
低密度中性粒细胞（LDN）是一种独特的中性粒细胞亚群，在胃肠道癌症等病理条件下数量升高。LDN 可从患者的腹腔冲洗液或灌洗液中分离获得。
首先，过滤灌洗液以去除组织碎片。离心滤液以获得含有血细胞（包括低密度中性粒细胞，LDN）的沉淀。将沉淀重悬于适当的缓冲液中。将此悬液铺加在适合LDN分离的适宜密度梯度介质上。
通过离心分离不同密度的血液成分。密度较高的红细胞形成底层，密度最低的血浆组分位于最上层，而密度较低的低密度中性粒细胞与其它单个核细胞共同位于中间层。
将中间层转移至含有封闭试剂的新离心管中。该试剂组分可封闭所有非靶细胞表面的非特异性结合位点，从而在后续标记过程中提高对低密度中性粒细胞（LDN）的特异性。
加入针对LDN表面过表达的特定细胞表面分子的抗体偶联微珠。孵育，使抗体-微珠复合物与LDN上的靶分子结合。
将孵育后的悬液通过置于磁场中的柱子。在磁场作用下，所有LDN-磁珠复合物会吸附在柱壁上，而未标记的细胞则流过柱子。
移除色谱柱。使用适当的缓冲液冲洗内容物，以洗脱并收集含有LDN的组分。
为了获取中性粒细胞，首先，在因胃肠道恶性肿瘤刚完成腹部手术的患者关闭切口前，立即向腹腔内注入1升无菌生理盐水，并充分冲洗腹腔至少1分钟。然后，搅动腹腔内的盐水，使用四个50毫升注射器回收200毫升灌洗液。
在实验室中，将腹腔灌洗液通过100微米尼龙滤膜转移至各个50毫升离心管中，用于离心。将沉淀物重悬于5毫升含0.02% EDTA的PBS中，并将每份细胞悬液小心地铺加到3毫升密度梯度溶液上。经密度梯度分离后，从每根离心管中收集2至3毫升中间层，再用每管10毫升新鲜含EDTA的PBS洗涤腹腔液样本。将沉淀物倒入10毫升新鲜含EDTA的PBS中进行额外洗涤，并将细胞稀释至每60微升磁性激活细胞分选（MACS）缓冲液中含有1×10⁷个细胞的浓度。
在4°C条件下，用20 µL Fc阻断剂封闭非特异性结合10分钟，随后加入20 µL抗CD66b磁珠。4°C孵育10分钟后，用500 µL MACS缓冲液洗涤并重悬细胞，将细胞加入置于合适磁力分离器磁场中的适当大小的磁性分离柱中。当所有CD66b阴性细胞流过分离柱后，向柱储液器中加入15 mL新鲜MACS缓冲液，并将分离柱从磁力分离器转移至一个新的锥形管中。随后立即用力冲出分离柱，使磁性标记的CD66b阳性细胞被冲洗至管中。