5-甲基胞嘧啶斑点印迹法测定 DNA 甲基化程度

DNA甲基化是一种表观遗传修饰，涉及在DNA的胞嘧啶碱基上添加甲基以形成5-甲基胞嘧啶。这种修饰改变了基因表达。

要通过点印迹定量 DNA 甲基化，请采集源自处于不同去分化阶段的人软骨细胞的基因组 DNA 样本，这些软骨细胞表现出不同水平的甲基化胞嘧啶。

用氢氧化钠（一种强碱）处理 DNA 样品并加热。这种处理会破坏两条 DNA 链之间的氢键，导致 DNA 变性。加入醋酸铵中和碱，防止DNA过度降解。

取尼龙膜，将变性 DNA 样品点为点。带负电的 DNA 通过静电相互作用与带正电荷的尼龙膜结合，导致其在固体载体上被印迹。

用封闭缓冲液处理印迹膜以防止非特异性结合。接下来，将抗-5-甲基胞嘧啶抗体加入膜中，并孵育。这些抗体仅与 DNA 上的甲基化胞嘧啶结合。

洗涤以去除未结合的抗体，并加入与一抗特异性结合的化学发光酶偶联二抗。

膜上添加化学发光底物。抗体上的酶与底物反应产生化学发光——产生不同强度的点。

膜进行成像并测量点的强度，该强度与每个样品中的 DNA 甲基化程度相对应。

95 摄氏度下将分离的 DNA 在 0.1 摩尔氢氧化钠中变性 10 分钟来开始此过程。在冰上用1摩尔醋酸铵中和DNA，然后用双蒸水稀释两倍。

点印迹中最关键的步骤是将样品点到膜上，缓慢而小心地进行。尝试将每个斑点区域的直径最小化到 3 到 4 毫米。

使用窄口移液器吸头，小心地将 2 微升连续稀释的基因组 DNA 点到网格中心的带正电荷的尼龙膜上。在 80 摄氏度下吸干膜 30 分钟。接下来，通过将膜浸泡在TBST中的5%BSA中，在室温下轻轻摇晃1小时，阻断非特异性抗体结合位点。

1小时后，在TBST中洗涤膜3次，每次5分钟。将膜与小鼠抗5-甲基胞嘧啶单克隆抗体在TBST中在4摄氏度下孵育过夜。第二天，在TBST中洗涤膜3次，每次5分钟。

然后，与二抗——辣根过氧化物酶偶联的绵羊抗小鼠免疫球蛋白G在室温下在TBST中孵育一小时。像以前一样在TBST中洗涤膜后，将酶底物加入膜中，孵育5至10分钟。最后，根据制造商的说明使用化学发光试剂盒可视化二抗信号。