使用细胞外通量分析仪实时监测人 NK 细胞中的能量代谢

从含有单层活化自然杀伤细胞的粘合剂涂层测定板开始。

放置一个预校准的传感器盒，其中包含嵌入荧光团的传感器探针，周围有多个进样口。

将各种线粒体呼吸抑制化合物加载到小柱的不同端口中。

在细胞外通量分析仪中，传感器通过自动化合物注射来测量细胞的耗氧率或 OCR。

在第一次注射中，寡霉素进入细胞的线粒体并与电子传递链或 ETC 的复合物 V 相互作用，阻断 ATP 合成并降低 OCR。

第二次注射引入 2,4-二硝基苯酚——一种质子载体，可将质子穿梭在线粒体膜上，导致质子渗漏。为了恢复膜电位，耗氧量增加，使OCR最大化。

最后，在第三次注射时，鱼藤酮和抗霉素A分别与ETC的复合物I和III结合，停止ETC并将OCR降低到最低水平。

抑制剂的实时 OCR 配置文件揭示了自然杀伤细胞的能量代谢。

实验前一天，打开分析仪，让它升温到37摄氏度。打开传感器盒包装，将盒与实用板分开。然后，将 200 微升校准溶液添加到实用板的每个孔中，并将传感器盒放回原处，确保传感器完全浸没

为获得最佳结果，请将滤芯在 37 摄氏度下在适当加湿的无二氧化碳培养箱中孵育过夜。要制备粘合剂涂层板，请将 25 微升细胞粘合剂溶液移液到板的每个孔中，并在室温下孵育 20 分钟。然后，取出溶液，每孔用200微升无菌水洗涤板两次。

细胞培养罩内保持板打开 15 分钟，让孔干燥。将先前分离的NK细胞以200倍g 离心五分钟。然后，除去上清液并在温热的线粒体应激试验培养基或糖酵解应激试验培养基中洗涤细胞。再次沉淀细胞，并将它们重悬于同一培养基中至首选的细胞浓度。将每孔 180 微升细胞悬液接种到测定板中。

使用孔 A1、A12、H1 和 H12 作为背景校正的对照孔，向这些孔中添加 180 微升测定培养基。将板在无二氧化碳培养箱中在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。将板以 200 倍 g 离心五分钟。然后，在显微镜下观察细胞，检查它们是否在孔底形成单层。

细胞再孵育 25 分钟。将工作溶液加热至 37 摄氏度，并根据需要将其 pH 值重新调整至 7.4。将先前制备的用于线粒体应激测试或糖酵解应激测试的化合物加载到水合传感器盒的端口 A、B 和 C 中。设置程序时，将加载的传感器盒放回培养箱中。要设置细胞外通量测定方案，请打开软件，并使用组定义来定义预处理条件。

使用"板图"选项卡指示具有相似条件的孔组。另外，指示背景校正和空井。然后，在"协议"选项卡中设置程序。启动程序并将传感器盒和实用板放在托盘上。校准步骤后，用附着的细胞更换测定板的校准板。运行完成后，检索数据并对其进行分析。