小鼠原代小脑颗粒神经元的分离和培养

取一个新鲜收获的小鼠大脑。

分离小脑并去除其膜层。

从腹侧，去除血管网络。

小脑切成碎片并将它们转移到装有缓冲液的管中。

心并丢弃含有碎屑的上清液。

添加胰蛋白酶（一种蛋白水解酶）来消化组织的细胞外基质并松弛细胞。

加入含有胰蛋白酶抑制剂和DNase的缓冲液。

剂会阻止胰蛋白酶活性，而 DNase 会降解任何污染的 DNA。

机械解离组织以形成细胞悬液，包括小脑颗粒神经元和非神经元或神经胶质细胞。

细胞悬液转移到管中。

添加缓冲区。离心并除去上清液。将细胞重悬于培养基中，并将它们接种到涂有聚-D-赖氨酸的培养板上。

细胞附着在涂层表面上。

添加抗代谢物以消除增殖的神经胶质细胞并产生小脑颗粒神经元的纯培养物。

为了分离小脑，将大脑置于补充有硫酸镁的解剖溶液中，并将溶液和大脑放在冰上。

在解剖显微镜下，使用细镊子取出脑膜。然后，在补充硫酸镁的解剖溶液中从大脑中解剖出小脑。这有助于剥离剩余的脑膜，并允许人们进入层与层之间清洁小脑皱襞。

神经元培养物中脑膜的存在会导致细胞不健康并最终导致细胞死亡。因此，在进行培养之前确保完全切除脑膜非常重要。

之后，将小脑转向腹侧并确保去除脉络丛。接下来，将小脑汇集到装有1毫升补充硫酸镁的解剖溶液的35毫米培养皿中。将组织切成小块，然后将它们转移到装有 30 毫升硫酸镁缓冲解剖溶液的 50 毫升管中。

在此步骤中，将装有切碎的脑组织的 50 毫升管以 644 倍 g 和 4 摄氏度离心 5 分钟。之后，除去上清液，加入10毫升胰蛋白酶解剖液。然后，在37摄氏度下高速摇动桌子15分钟。

10 毫升胰蛋白酶抑制剂溶液-I 加入试管中，轻轻摇晃两分钟。随后，将试管在 644 倍 g 和 4 摄氏度下离心 5 分钟。五分钟后，除去上清液，加入2毫升胰蛋白酶抑制剂溶液-II，然后将其转移到15毫升管中。

然后，在 15 毫升管中研磨组织，直到溶液变得浑浊。让它静置五分钟。然后取出透明上清液并将其转移到装有 1 毫升补充氯化钙的解剖溶液的新管中。

将另外 2 毫升胰蛋白酶抑制剂溶液-II 添加到装有沉淀的管底部。再次研磨并静置五分钟。取出上清液并将其添加到含有上一步上清液的管中。重复此过程，直到大部分组织机械解离。

毫升上清液将0.3毫升补充氯化钙的解剖溶液添加到上清液集合中。混合管中的内容物，然后在室温下以 644 倍 g 离心五分钟。之后，除去上清液。向沉淀中加入 10 毫升新鲜培养基并混合。

然后，计数活细胞并将它们稀释至每毫升 1.5 x 10⁶ 个细胞的浓度。将细胞接种在先前制备的聚-D-赖氨酸板上。对于四孔板，放置 0.5 毫升样品，每孔提供 7.5 x 10⁵ 个细胞。对于 35 毫米培养皿，接种 4 毫升样品，每板提供 6 x 10⁶ 个细胞。对于盖玻片，接种0.5ml，每孔7.5 x 10⁵个细胞。

24小时后，加入AraC两个板以减少神经胶质细胞污染。如果要将细胞维持七到八天，则在第3天重复此处理，并将培养物保持在37摄氏度的5%CO₂培养箱中。