从斑马鱼胚胎中建立原代视网膜神经节细胞培养

从早期发育阶段的斑马鱼胚胎开始，将其置于胚胎培养基中。

去除包被在胚胎外的保护性膜——绒毛膜，并将胚胎转移至含有培养基的新培养皿中。

移除胚胎的尾部，然后分离头部，并轻轻将眼睛从头部剥离。

眼睛包含视网膜，这是一层薄薄的组织，其中含有视网膜神经节细胞。 

将眼睛转移到含有斑马鱼细胞培养基的离心管中。

通过机械法解离眼球，释放视网膜神经节细胞并制成单细胞悬液。

取置于含有斑马鱼培养基的培养皿中的盖玻片。

盖玻片涂覆有合成聚合物和一种黏附蛋白。

将细胞转移至盖玻片中央并进行孵育。

视网膜神经节细胞附着在包被的表面，并进一步发育出称为轴突的长突起。

从培养箱中取出斑马鱼胚胎，将其浸入含有70%乙醇的35毫米组织培养皿中，持续5至10秒以进行消毒。使用移液管将胚胎转移至含有无菌E2培养基的E2 Media #1培养皿中，以洗去多余的乙醇。随后，将胚胎转移至E2 Media #2培养皿中，用尖头镊子去除胚胎的绒毛膜。最后，将胚胎转移至E2 Media #3培养皿中进行解剖操作。

使用一对精细镊子，用其中一把镊子夹住并固定卵黄前部的胚胎，用另一把镊子去除卵黄囊后部的尾部。用镊子夹住颈部并移除头部，使脑和眼暴露于 E2 培养基中。用精细镊子的尖端轻轻滚动眼睛，同时用第二把镊子压住头部组织以固定。将四个眼球转移至预先准备好的含有 ZFCM+ 的离心管之一中。

用 P20 移液器轻柔地上下吹打约 45 次，以解离细胞。将含有解离细胞的 ZFCM+ 转移至盖玻片中央。将培养物置于 22 摄氏度的台面上，使用聚苯乙烯泡沫架以吸收振动。成像当天，在显微镜下检查细胞，以确认 RGC 轴突的生长情况。