研究农药对Caenorhabditis elegans神经元的影响

从含有表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的琼脂平板开始。

向培养皿中加入无菌水，轻轻摇晃以悬浮线虫，然后将其转移至离心管中。

让线虫沉降，然后吸除多余的水分并重新悬浮。

将重悬的线虫转移至涂有农药的培养皿以及不含农药的对照培养皿中，然后进行培养。

根据其作用机制，该农药会特异性损伤某些神经元，导致神经元肿胀，并降低GFP表达。

将线虫转移至含有麻醉剂的琼脂糖垫上，然后加盖盖玻片。

将玻片置于荧光显微镜下观察。首先使用相差模式观察线虫，然后切换至荧光模式。

在杀虫剂处理的线虫中，神经元表现出荧光减弱、胞体肿胀以及神经突起出现间隙，表明存在神经退行性效应。

在对照组中，健康的神经元显示出完整的胞体并伴有明亮的荧光。

使用微量移液器将1毫升无菌水加入线虫培养皿中。接着，轻轻晃动液体以悬浮线虫。然后，将含有线虫的液体转移至1.5毫升微量离心管中。静置10分钟后，待线虫依靠重力沉降，小心吸除至少500微升上清液并弃去。

然后重悬线虫，使用切去尖端的黄色移液器吸头，将50至100微升悬浮的线虫转移至每个处理平板中，确保每个平板至少含有10只成年线虫。准备两张载玻片，仅在载玻片的一侧贴上标签胶带，以形成厚度均匀的垫片。

然后，在实验台面上将一张干净且未使用过的载玻片置于两者之间。使用移液器吸取10 µL融化的琼脂糖，滴加到载玻片中央。接着，将另一张干净的载玻片垂直盖在含有液滴的载玻片上，压平液滴，使琼脂糖液滴展成与标签胶带相同厚度的薄层。

随后，施加稳定压力以分离两张载玻片。然后将琼脂面朝上的载玻片放置在实验台面上，静置干燥一到两分钟后再使用。向已制备好琼脂糖垫的载玻片上添加线虫时，可在琼脂垫上加入一滴5微升含有1摩尔叠氮化钠的水溶液，以麻醉线虫并使其便于移动。

然后，使用经过灭菌的线虫挑取工具，将每个处理组至少10条线虫转移至载玻片上的液滴中，转移前后均应对工具进行灭菌。接着，用镊子夹取盖玻片，以一定角度放置并缓慢放下，覆盖在液滴上。

随后，将制备好的湿片置于荧光显微镜下观察蠕虫，先在10倍放大倍数下使用相差显微镜观察，再在40倍放大倍数下结合相差显微镜与荧光照明进行观察。

每次将一个制备好的湿片置于显微镜载物台上，并使用显微镜的固定夹将其固定。然后，先用最低放大倍数的物镜（通常为 10x）观察湿片，采用明场或相差显微镜观察并聚焦线虫。

在视野中找到线虫后，使用显微镜的细调焦旋钮对其进行聚焦。然后，通过旋转拨盘将照明切换至荧光模式，并将光线导向相机以捕获数字图像。

接下来，使用成像软件调整照明，使神经元明亮可见，但不出现过饱和。在适当时候，以与细胞图像相同的放大倍数拍摄一张独立的尺子图像，以便为图像提供放大比例尺。