使用视黄酸报告细胞系测量神经球中的视黄酸水平

取视黄酸（RA）报告细胞的贴壁培养物。

这些细胞携带含有 lacZ 基因的转基因构建体，该基因编码由视黄酸反应元件 （RARE） 调节的 β-半乳糖苷酶。

子源自小鼠脊髓干细胞神经球的解离细胞。孵化。

神经球细胞释放 RA，RA 进入报告细胞并与 RARE 上的受体复合物结合。

这会触发转录激活因子复合物的形成，启动β半乳糖苷酶表达。

固定剂代替培养基以保持细胞形态。

取出固定剂并用缓冲液洗涤。

添加透化缓冲液以透化细胞膜。

引入β-半乳糖苷酶底物并孵育。

底物进入报告细胞，β-半乳糖苷酶将其水解成不稳定的产物，氧化和二聚化，形成蓝色沉淀物。

用缓冲液洗涤。

使用酶标仪测量吸光度并将其与标准曲线进行比较，以量化神经球细胞的 RA 分泌。

对于神经球共培养，首先将神经球培养物转移到 15 毫升管中。以 200 g 旋转试管 10 分钟，除去除 1 毫升外的所有上清液。然后用P 1000移液器研磨内容物。

现在，使用小体积来确定解离细胞的密度。然后，将 100,000 个解离的神经球细胞接种在 F9 RARE-LacZ 细胞上。用每种神经球培养类型加载三个孔。现在，一定要为标准曲线准备孔。

式三份，在F9 RARE-LacZ培养基中加入100微升全反式RA溶液，通过七种不同浓度的连续稀释制备。包括未经处理的细胞的阴性对照。最后，培养满载的 96 孔板过夜。

取出培养基并每孔使用 100 微升 2.5% 戊二醛固定培养物。让板在室温下孵育15分钟。之后，取出固定剂并用200微升PBS洗涤孔两次，每次洗涤10分钟。

接下来，用 200 微升 LacZ 洗涤液洗涤孔 3 次，每次洗涤 10 分钟。在第三次洗涤期间，在用箔纸包裹的 15 毫升管中制备 X-gal 染色溶液。此外，为 96 孔板准备一个加湿室。

现在，向每个孔中加入 200 微升 X-gal 染色溶液。将板放入加湿室内，并在 37 摄氏度下孵育。孵育后，取出LacZ染色液并用200微升PBS代替。然后，测量 610 纳米处的吸光度并对板进行成像。