二层共培养小学的大鼠皮层神经元和神经胶质
2011年11月12日
在这里，我们培养大鼠皮层神经元胶质滋养层的存在提供了一个协议。培养的神经元建立极性和创建的突触，可以用于各种应用，如电生理，钙成像，细胞存活率检测，免疫细胞化学，和RNA / DNA /蛋白分离，神经胶质细胞的分离。
该程序的目标是在一层支持其生长的神经胶质细胞存在下培养原代神经元。这些神经元稍后可以分离为纯神经元群进行分析。这是通过首先培养原代神经胶质细胞来实现的。
第二步是将神经胶质细胞传代培养到一个表面上，这将与培养的神经元相反。然后将神经元神经胶质细胞层组合成一个稳定的共培养系统。最终，细胞化学分析显示成熟神经元的纯层发育。
嗨，我叫 Anna T，是德雷塞尔大学 Dr.Olympia Muci 实验室的学生。在这里，我们将演示如何在神经胶质细胞供油层存在的情况下在皮层神经元中培养。这项技术最初由 Gary Banker 及其同事开发，并由 Muci 博士和芝加哥大学的 Richard Miller 实验室学习，然后我们将其应用于我们的实验需求。
与纯神经元培养相比，该技术的主要优点是神经胶质细胞释放的奖杯因子支持神经元生长和分化。而神经元稍后可以被分离为一个纯种群。为了准备解剖，将无菌工具放入 70% 乙醇中，加入 4 毫升冷解剖，中等至 60 毫米的培养皿，然后在冰上解冻 2.5% 的 DNA 和。
将 2 到 4 天大的幼崽斩首后，将每个头部的头部放入 100 毫米的无菌培养皿中。在皮肤上划出一条中线，然后将皮肤向后拉，以露出头骨。然后用一把弯曲的剪刀在颅骨上做一个中线切口和两个横向切口，而不会损坏下面的脑组织。
在此之后，取出上颅骨以露出大脑，然后提取大脑并将其放入 60 毫米的培养皿中，进行 4 毫升冷解剖，之前在立体显微镜下制备培养基。分离半球，去除中脑并剥去脑膜。将所有解剖的大脑皮层收集在一个新的 60 毫米培养皿中，并加入新鲜的冷解剖培养基。
然后用一把弯曲的剪刀将纸巾切碎。随后将碎组织转移到 15 毫升无菌管中。用冷解剖培养基将体积调至 4.5 毫升，并加入 500 微升 2.5% 的行程。
然后将管子包裹在封口膜中，并将其放入 37 摄氏度的水浴中 15 分钟。同时，每 5 分钟倒置试管混合一次。接下来，将组织转移到新的 15 毫升试管中，并尝试尽量减少转移到试管中的含有夹层的解剖培养基。
现在用新鲜的解剖培养基将最终体积调至 4.8 mL，并加入 200 μL DNA 至终浓度为 60 μg/mL。然后用无菌的 5 毫升移液管轻轻研磨约 20 次，并加入 10 毫升胶质电镀培养基。等待 4 到 5 分钟，让大块组织沉淀在底部。
之后，将细胞悬液的顶部 80% 转移到 50 毫升试管中。然后通过额外的 2 到 3 毫升 GL 电镀来重复组织持续时间。中等。同样，让组织沉淀。
之后将前 80% 转移到之前的集合中。将总体积调至 20 毫升。接下来，以 280 次 G 离心 15 分钟，然后吸出旋发物并将细胞调色板重悬于 5 至 7 毫升 GGL 电镀培养基中。
然后为每个解剖的大脑添加额外的铺板，中等至 10 毫升，并将细胞充分混合。在每个 75 cm 方形培养瓶中接种 10 mL 细胞悬液。然后，在 37 摄氏度下孵育培养瓶。
24 至 48 小时后更换培养基，然后每 3 至 4 天更换一次，以准备 Therman 盖玻片。使用培养次级 ggl 的塑料盖玻片在每个清洗和高压釜 thermadox 的圆周周围加入三小滴熔化的对立塑料蜡。细胞将被接种在 thermadox 的这一侧。
我们的赛盟是手工制作的、可重复使用的 60 毫米嵌件，钻有约 52 毫米的孔。虽然市售的培养孔插入物也可以使用。下一步是用 PBS 洗涤初级 ggl 两次。
用力摇晃每个培养瓶以去除任何未附着的细胞。每个具有汇合初级 GGL 的培养瓶将提供大约 1000 万个星形胶质细胞。因此，我们通常每个实验使用 2 到 4 个培养瓶。
接下来，在 EDTA 中分离具有 0.05% trips的细胞。将两个培养瓶中的细胞混合到一个 50 mL 锥形管中，加入等量的 GGL 电镀培养基，然后在 280 倍重力下离心 15 分钟。吸出旋囊并将 GL 沉淀溶解在几毫升 GL 电镀中。中等。
使用血细胞计数器对细胞进行计数，并根据需要稀释细胞悬液。然后使用 Thermo on 板的 GL 电镀培养基将 500， 000 个细胞接种在 60 毫米培养皿或热盖玻片上。每个盖上 600 μL 细胞以逐滴方式滑动，两小时后，翻转每个 thermadox 以将细胞浸入神经胶质细胞铺板培养基中。
如果为神经元盖玻片准备 60 毫米次级神经胶质细胞培养皿，请在神经元解剖前一天晚上更换培养基以结束 2 个。在此过程中，要准备 15 毫米玻璃盖玻片，请加入三小滴熔化的对位爆炸。在每个无菌盖玻片的圆周上打蜡，以便物理分离细胞层并防止细胞刮擦外套。
盖子用每毫升 0.5 毫克的聚赖氨酸将所有 60 毫米培养皿滑入两小时或过夜。然后用无菌水洗涤两到三次，让它们完全干燥，以准备神经元解剖。对怀孕 17 天的大鼠实施安乐死。
用 70% 乙醇喷洒，并在皮肤内侧切开以露出子宫。之后，取出所有胎儿并将它们放入 100 毫米无菌培养皿中。在快速解剖和斩首每个胎儿后，将每个头部放入一个 60 毫米的培养皿中，在立体显微镜下加入 4 毫升冷解剖培养基。
使用一对镊子拉开皮肤和颅骨，提取大脑，分离半球并去除中脑和脑膜，从而隔离大脑皮层。将所有解剖的皮质收集在带有冷解剖培养基的新鲜 60 毫米培养皿中。然后用一把弯曲的剪刀将组织切成大约一毫米的小块。
将碎纸组织转移到 15 毫升无菌管中。用冷解剖培养基将体积调至 4.5 毫升，并向组织中加入 500 微升 2.5% 的行程。遵循此。
用封口膜包裹试管，并将其置于 36 摄氏度的水浴中 15 分钟。同时，每 5 分钟倒置试管混合一次。随后，将组织转移到新的 50 毫升试管中，并尝试尽量减少转移到试管中的含有 tripsin 的解剖培养基。
用新鲜的解剖培养基将体积调至 4.8 毫升，并加入 200 微升 D Ns，使最终浓度为 60 微克/毫升。然后用无菌的 5 或 2 毫升移液器研磨大约 10 次。根据需要重复此步骤。
使用火抛光意大利面移液器分离大部分组织，让剩余的组织块在底部沉淀 4 到 5 分钟。然后，去除上层单细胞悬液，同时留下沉淀的组织块。将其转移到具有等体积神经元电镀培养基的新试管中，并轻轻混合。
然后使用血细胞计数器对细胞进行计数，并将它们接种在 15 毫米盖玻片上，形成约 35， 000 个细胞（200 微升），或在 60 毫米培养皿上（约 100 万个细胞，形成 3 毫升）。孵育后，将细胞在 36.5 摄氏度下孵育 3 至 4 小时。将神经元层和神经元的次级 GGL 组合在 60 毫米培养皿上。
用温热的 DMEM 洗涤细胞。将培养基改为 4 毫升 N 2 培养基，并向每个板中加入 1 个 thermon 和 ggl。使 GL 面向神经元进行神经元盖玻片，将 3 到 5 个盖玻片转移到每个 60 毫米的次级 GGL 培养皿中，神经元在接种后 24 小时向每个培养皿中加入 10 微摩尔的胞嘧啶 Beta D Arab azi，以防止神经胶质细胞增殖，此处显示为来自神经胶质细胞的神经元的一个例子通过层状共培养。
电镀过程在 5 小时后继续在此阶段伸长。这是接种后 12 天来自神经胶质细胞双柱共培养的神经元示例。在这个阶段，细胞的延伸轴突和虱卵清晰可见。
随着神经元的成熟，树突状 ABA 变得更加复杂，并在电镀后大约 2 到 3 周形成突触接触。如图所示，可以看到许多树突棘。在执行这项技术时，快速工作很重要，并且保持每种试剂的无菌性是我们的培养物中缺乏抗生素。
培养基使细胞极易受到污染。
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概述
本文介绍了一种在胶质细胞培养层旁培养大鼠皮层神经元的协议。这些神经元发展出极性并形成突触，允许它们随后被分离用于各种实验应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 神经生物学
背景
- 培养初级神经元对于研究神经元功能至关重要。
- 胶质细胞为神经元的生长提供必要的支持。
- 分离的神经元可用于多种分析。
- 理解神经元-胶质细胞相互作用对于神经科学研究至关重要。
研究目的
- 建立一种可靠的大鼠皮层神经元培养方法。
- 创建与胶质细胞的稳定共培养系统。
- 使能够分离成熟神经元以进行进一步分析。
使用的方法
- 培养初级胶质细胞。
- 将胶质细胞转移到合适的表面上进行亚培养。
- 将神经元和胶质细胞层结合成共培养系统。
- 进行细胞化学分析以评估神经元的成熟度。
主要结果
- 成功建立了共培养系统。
- 形成了纯净的成熟神经元层。
- 神经元表现出极性和突触形成。
- 分离的神经元适合于各种实验应用。
结论
- 该协议有效地支持皮层神经元的生长。
- 分离的神经元可用于电生理学和成像研究。
- 该方法增强了对神经元发育的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia enables the generation of physiologically relevant neuronal systems for early discovery and mechanistic studies. This model supports predictive confidence in neuronal function assays by recapitulating neuron-glia interactions and minimizing non-neuronal contamination. Its scalability and adaptability make it valuable for portfolio-wide assay development and translational neuroscience research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal growth, survival, and differentiation in a controlled, brain-like environment.
- Supports mechanistic de-risking by modeling neuron-glia interactions absent in immortalized cell lines.
- Facilitates functional target validation through the formation of mature synapses and neuronal networks.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible, virtually pure neuronal layer for quantitative imaging, electrophysiology, and molecular assays.
- Allows standardization of substrate and feeder layer configurations for diverse assay platforms.
- Enables reliable compound evaluation by minimizing glial contamination and supporting neuronal health.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant neuron-glia interactions for translational biomarker discovery.
- Supports continuity from in vitro discovery to preclinical validation by mimicking in vivo brain microenvironments.
- Reduces biological risk in advancing neuronal targets by providing physiologically relevant data.
Pipeline & Workflow Integration
This co-culture system fits within the early discovery to lead identification continuum, supporting both mechanistic studies and scalable assay development for neuroscience portfolios.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on neuronal differentiation and synaptic formation in a controlled system.
- Screening: Delivers assay-ready, pure neuronal populations for high-content imaging and functional readouts.
- Analytics: Supports quantitative measurement of neuronal morphology, synapse density, and viability.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with in vivo brain biology for biomarker and target validation.
- Enterprise Reuse: Adaptable for various neuronal subtypes and experimental endpoints across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal assays.
- Operational Value: Standardizes neuron preparation and minimizes glial contamination for reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing physiologically relevant data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuronal targets and assay platforms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuronal and glial culture techniques.
- Demands sterile technique and specialized substrates (glass or plastic) for optimal results.
- Needs coordination of glial and neuronal preparation timelines for successful co-culture.
- Adaptable to different neuronal types but may require protocol optimization.
- Susceptible to contamination due to absence of antibiotics in culture media.
