RNAi介导的基因敲除和在体内埃及伊蚊蚊子

在这个协议中，我们结合RNAi介导的基因沉默

该视频协议展示了一种有效的技术，可以敲除昆虫中的特定基因并进行新的生物测定以测量排泄率。我们今天要演示的技术将 RNAi 介导的基因敲低与体内利尿测定相结合。它可以用来研究不同 A 端口物种的利尿，我们实际上开发了它来研究两种不同蚊子中水通道蛋白水通道的功能。

我今天要演示的协议分为两部分。第一个演示说明了如何构建一个简单的蚊子注射装置，并准备双链 RNA 并将其注射到胸部蚊子中以进行 RNA 介导的基因敲除。第二个演示说明了如何使用体内生物测定法作为第一步来测量蚊子的排泄率，以便进行 RNAi 介导的基因敲除，合成针对目标基因的特异性双联链 RNA 和受控双联链 RNA 所需的其他设备和材料包括一个带有收集瓶的抽吸器，用于蚊子收集。

细尖镊子，将 CO2 飞垫连接到 CO2 气瓶乙醇上，以清洁飞垫立体显微镜，如果需要，可以使用光源针拔器。玻璃毛细管针头，以 1 毫米为增量，用于注射蚊子的微型注射器，注射后放置蚊子的容器，以及注射后蚊子的食物来源，例如 20% 蔗糖、浸泡的棉球或浸泡过水的葡萄干。可以使用剪刀构造一个简单的微型注射器。

一根金属针头、一个玻璃毛细管、一个 1 毫升注射器、一个塑料移液器吸头和切割成约 40 厘米长的管子。将注射器针座的尖端切割成 0.2 毫升刻度，并拆下橡胶柱塞头。使用金属针在柱塞头上打孔。

将玻璃毛细管放入孔中，并将头部放回注射器中。然后将注射器的尖端放在管子的一端，将 1 毫升塑料移液器吸头放在另一端。这将用作吹嘴。

或者，可以使用 10 毫升注射器来产生注射所需的气压。接下来，将玻璃毛细管针头放入橡胶柱塞头孔中，并折断针尖，使其宽度足够大，以便液体流过。将注射针浸入制备好的 D-S-R-N-A 样品中，然后用咬嘴或注射器吸取液体，将液体样品吸入注射针中。

用电池供电的抽吸器将蚊子收集到收集瓶中。在小瓶上盖上盖子，并将其放在干净的 CO2 垫上以麻醉蚊子。或者，可以在冰上麻醉蚊子。

在开始注射过程之前丢弃所有雄性。它们可以使用 Feather 或 Paintbrush 在 CO2 Pad 上进行作。用镊子抓住蚊子的腿或翅膀，以免受伤。

当准备注射第一只蚊子时，用镊子轻轻支撑胸部的一侧，将针尖插入胸部的另一侧。最好注射到角质层的薄部分，避免将针头推入胸部太深。针头就位后，将液体吹入蚊子体内。

双链。RNA 分散在血淋巴中并被细胞吸收，从而触发 RNA 眼介导的靶向牛仔裤敲低。注射后，将蚊子放入容器中储存。

例如，一个一品脱的蜡线，纸板杯，用纸板盖固定网眼覆盖物。一旦所有的蚊子都放入容器中，应将容器放置在环境受控的室内进行孵化，还应为蚊子提供食物来源，例如 20% 蔗糖、肥皂、棉球放置在网状覆盖物顶部世代相传。如今，昆虫利尿作为一种简单的研究模型系统，是有吸引力的研究人员。

像 RNAi 这样的技术可用于在分子水平上研究利尿。本视频中演示的技术应该提供了一种在体内研究利尿的简单方法。雌性蚊子在注射 PBS 缓冲液后两分钟内开始排泄尿液，因此在开始排泄之前测量体重很重要。

对于本协议的第二部分，我将演示如何在绝地蚊子中进行体内利尿测定。敲除方案中不需要但本方案中需要的其他材料和设备、RPBS 缓冲溶液和用于进行重量测量的分析精密天平，天平应能够达到第 10 毫克的精度在收集蚊子记录之前，使用分析精密天平记录带盖的空收集瓶的重量。该样品瓶将用于所有后续测量。

装有蚊子的小瓶和盖子放在精密天平上，测量五只雌性的初始重量。麻醉五只雌性蚊子后，您应该将它们排在 CO2 垫上，以便更容易使用微型注射器。当针头插入胸部时，您需要将 PBS 缓冲液吹入蚊子体内。

注射后，轻轻地将蚊子放入收集瓶中并盖上盖子。将带盖的现场收集瓶放在精密天平上，对五只注射的蚊子进行第一次重量测量。这组五只蚊子的重量可以通过以下方法计算：取带盖的现场收集瓶的重量，减去带盖重量的空收集瓶的重量。

子的测量应每 30 分钟进行一次，但可以根据排泄率调整为更短或更长的间隔。30 分钟后，用抽吸器将 5 只蚊子收集到同一个带盖的收集瓶中。然后，将带盖的现场收集瓶放在精密天平上，进行下一次重量测量。

利尿测定在不同温度下使用两种蚊子 ADA aegypti 和 kyx kti 进行。注射后第一个小时的排泄率以百分比表示。该图显示，随着温度的升高，利尿作用显著增加。

我们还观察到两种蚊子之间的排泄率存在差异。这里介绍了体内利尿测定的广泛未来应用。除了 RNAI 等反向遗传学方法外，它还可用于研究药物对昆虫利尿的影响，例如信号转导抑制剂等。

它也是一种强大的检测方法，可以研究 Target 实例中 xeno Biotic 清除的过程。