Name: 在体内电穿孔Morpholinos到成年斑马鱼视网膜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 学习利用电穿孔技术将Morpholinos导入成年斑马鱼视网膜的方法，实现特定蛋白的条件性敲低。该技术结合玻璃体腔注射与电穿孔，为研究视网膜再生机制及视网膜退行性疾病治疗策略提供重要工具。

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作者谨此感谢弗赖曼生命科学中心和斑马鱼研究中心工作人员对斑马鱼的悉心照料与维护。

1. Morpholino 准备：
<ol>
	<li>所有吗啉寡核苷酸应通过 GeneTools（Philomath, OR）定制设计并订购。我们使用带正电荷的丽沙胺标记的吗啉寡核苷酸，以便在电穿孔过程中将其引导向负极。我们曾尝试使用该技术将带负电荷的荧光素标记的吗啉寡核苷酸靶向正极，但未成功。将 300 nmol 吗啉寡核苷酸溶解于 100 μl 无核酸酶的水中，配制成 3 mM 的溶液。将该溶液分装至多个石蜡密封的微量离心管中。避光、室温保存。</li>
	<li>通过将 5 μl 吗啉寡核苷酸（或用于稀释吗啉寡核苷酸的水作为空白对照）稀释至 95 μl 的 0.1 N HCl 中，测定其浓度。将分光光度计的波长（λ）设为 265 nm。使用以下公式计算该吗啉寡核苷酸的常数： 
	 
	常数 = 该吗啉寡核苷酸特有的分子量 × 1000 / 摩尔吸光系数。 
	 </li>
	<li>可在每批吗啉寡核苷酸附带的“寡核苷酸特性”（Oligo Properties）表格中找到分子量和摩尔吸光系数数据。先检测空白对照以确认基线读数，再测定每个稀释后吗啉寡核苷酸的吸光度。将每个吗啉寡核苷酸在 265 nm 处的吸光度值乘以其对应的常数及稀释倍数，得到以 ng/μl 为单位的浓度。再将该数值除以分子量，换算为 mM 浓度。如有需要，将吗啉寡核苷酸稀释至工作浓度。</li>
</ol>
2. 去除外层角膜：
<ol>
	<li>使用浓度为 1.0 mg/ml 的 Tricaine 或 2-苯氧乙醇溶于斑马鱼养殖用水中，对 6 至 12 月龄的成年斑马鱼进行麻醉。</li>
	<li>用湿润的纸巾包裹斑马鱼，覆盖其鳃部，但暴露眼睛。将包裹好的鱼置于体视显微镜下，调节放大倍数，使眼睛直径约占视野的三分之一（图 1）。</li>
	<li>使用 Dumont #5 镊子夹住视裂附近区域的外层角膜。该组织在图 1 中呈红色，并标注为“OC”。箭头“CL”所指处可见轻微突起或唇状结构。以低角度（即约 10 度）沿眼球表面拉动，以去除外层角膜。经过练习后，此操作可一次完成。若镊子打滑，可重新夹取组织并再次以低角度拉动直至去除。若角膜附着较紧，拉动时可能导致眼球从眼窝中脱出。此时可用另一把镊子固定眼球，防止其脱位。</li>
</ol>
3. 角膜切口和吗啉代注射：
<ol>
	<li>在去除角膜外层后，立即在瞳孔与虹膜交界处的角膜上做一个小切口（图2）。使用蓝宝石刀片手术刀完成此操作（参见材料）。</li>
	<li>将0.5 μl的3.0 mM吗啉寡核苷酸溶液吸入配有33 gauge可拆卸钝头针头的汉密尔顿注射器中（参见材料）。反复吹打以去除管路中的气泡。通过切口小心地将针头插入玻璃体腔内（图2）。切勿插入过深，否则会刺破视网膜或移位晶状体。</li>
	<li>缓慢将吗啉寡核苷酸溶液注入玻璃体腔。根据鱼类的年龄不同，玻璃体腔大约可容纳0.5 μl。随着溶液注入，应可观察到无色的玻璃体从切口处溢出。持续注射直至有少量吗啉寡核苷酸溶液从切口处渗出。此时应能清晰看到眼内带有荧光标记（lissamine-tagged）的吗啉寡核苷酸。</li>
	<li>注射完成后，将鱼放回水箱中恢复。我们通常仅注射左眼，右眼作为未注射对照；但也可对双眼同时进行电穿孔处理。</li>
</ol>
4. 电穿孔：
<ol>
	<li>注射约10条鱼后，将一条已注射的鱼重新麻醉，并用湿润的纸巾包裹，仅覆盖鳃部，但使眼睛暴露。将鱼转移至培养皿中。戴上乳胶或类似材质的手套，以避免接触麻醉剂。在轻轻将鱼固定于培养皿底部的同时，向皿中加入麻醉剂（图3，左图）。</li>
	<li>使用直径为3 mm的铂板电极（见材料表）可将电穿孔脉冲局限在视网膜约一半的区域。我们通常以背侧视网膜为靶区。将正极电极轻轻向下压在眼球的腹侧半部。去除外层角膜后，眼球可轻松旋转，从而暴露眼球的背侧部分。</li>
	<li>在持续下压眼球腹侧的同时，将负极电极置于暴露的背侧眼球附近（约1–2 mm处）。注意不要让负极电极直接接触眼球，否则会损伤背侧视网膜。确定两电极间的合适距离后，使用电极手柄上的调节螺丝固定该间距，以便在电穿孔过程中保持稳定。这样可确保当正极电极压下就位时，负极电极与眼球保持最佳距离。</li>
	<li>使用CUY21方波电穿孔仪（见材料表）对眼球进行电穿孔。电穿孔参数应设置为连续两个50毫秒脉冲，电压为75 V，脉冲间间隔1秒。</li>
	<li>将鱼放回水族箱。我们通常在电穿孔后立即开始恒定光照诱导视网膜变性的实验方案。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
<ol>
	<li>电穿孔后3-5天内（取决于吗啉代寡核苷酸的稳定性），在视网膜切片的所有视网膜层中均可观察到丽丝胺标记（图4）。这可作为标记的吗啉代寡核苷酸存在的验证。</li>
	<li>电穿孔后最多可实现持续3-5天的完全蛋白敲低，具体时长取决于吗啉代寡核苷酸的效率（图5）。通常在光处理研究中，我们在吗啉代寡核苷酸电穿孔后3或4天收集眼球。操作方法是使用末端弯曲的Dumont #5B镊子（图6；材料）完整取出眼球，随后对组织进行免疫组织化学处理15。与所有敲低技术一样，必须展示出高效的敲低效果，以验证表型的可靠性。因此，我们建议获取针对目标蛋白的抗血清。或者，若无法获得特异性抗体，且所用吗啉代寡核苷酸靶向pre-mRNA的剪接受体或供体位点，则可阻断mRNA的有效剪接。在此情况下，可通过逆转录PCR扩增吗啉代处理RNA中侧翼序列，以确定阻断正常剪接模式的效率。</li>
	<li>当视网膜沿背腹轴从鼻侧向颞侧切片时，蓝色阴影区域（图6）代表最常因电穿孔操作本身而受损的视网膜区域。粉色阴影区域则代表通过电穿孔将吗啉代寡核苷酸导入视网膜细胞的靶向区域。</li>
</ol>
<img alt="显示角膜操作步骤的斑马鱼眼睛示意图；生物学研究方法图示。" src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1."> 
图1. 角膜上皮层去除过程的示意图。左侧面板显示了眼睛的主要结构特征，包括晶状体（L）、玻璃体（Vit）、视网膜（R）、外层角膜（OC）、内层角膜（IC）以及角膜突起（CL）。第一面板右下角标示了眼睛的方向，分别为前侧（A）、后侧（P）、背侧（D）和腹侧（V）。红色区域表示被去除的外层角膜。第二个面板展示了如何使用镊子夹住角膜突起，并以较低角度将外层角膜沿眼球表面拉出（第三个面板）。右侧面板展示了在牵拉角膜的同时，如何使用第二把镊子固定眼球以保持稳定。
<img alt="眼部注射操作示意图：切口、注射器插入、注射顺序图解。" src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2。"> 
图 2。 玻璃体内注射吗啉寡聚物的操作步骤示意图。在瞳孔与虹膜交界处的眼部位置做一个小切口（左图）。所形成的间隙应刚好足以插入一支已装有吗啉寡聚物溶液的33号针头（中图）。缓慢将0.5 μl溶液注入玻璃体腔内（右图）。随着玻璃体部分被丽丝胺标记的吗啉寡聚物替代，应可观察到少量玻璃体液从切口处溢出（右图）。
<img alt="斑马鱼电穿孔过程示意图：将鱼置于培养皿中，放大视野，施加电极。" src="/files/ftp_upload/3603/3603fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3。"> 
图3。 电穿孔实验的总体示意图。将已通过玻璃体内注射给予吗啉代寡核苷酸的麻醉斑马鱼轻轻包裹在湿润的纸巾中（左图）。纸巾应覆盖鳃部，但不得遮挡眼睛（中图）。轻压正极电极于眼球腹侧，使眼球背侧半部向外翻转出眼窝。将负极电极置于距眼球背侧半部约1 mm处，开始电穿孔操作（右图）。
<img alt="带有标注层的视网膜横切面；显微图像突出显示结构和细胞类型。" src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4."> 
图 4. 共聚焦图像，比较未通过玻璃体内注射荧光素标记的吗啉代寡核苷酸进行视网膜电穿孔（A）与经玻璃体内注射并电穿孔导入荧光素标记吗啉代寡核苷酸的视网膜（B）。荧光素标记信号存在于所有视网膜层及各类细胞中。ROS，视杆细胞外段；ONL，外核层；INL，内核层；GCL，节细胞层。
<img alt="PCNA 荧光显微镜图像；对照组与抗 PCNA 吗啉代寡核苷酸处理组；光照下 1-3 天的细胞增殖情况。" src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5。"> 
图 5。 共聚焦图像，比较在光诱导感光细胞死亡前，经对照吗啉代寡核苷酸（左图）和抗 PCNA 吗啉代寡核苷酸（右图）电穿孔处理的视网膜中 PCNA 的免疫定位。将暗适应的成年白化斑马鱼在电穿孔注射吗啉代寡核苷酸后，置于持续强光下 1、2 或 3 天。对照吗啉代寡核苷酸未能抑制光损伤视网膜中 PCNA 表达的上升，而抗 PCNA 吗啉代寡核苷酸在持续强光损伤三天期间，有效抑制了 PCNA 蛋白的表达。
<img alt="眼球解剖方法；示意图显示了用于分析的摘除及背侧/腹侧切片。" src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6."> 
图 6. 示意图（左图）显示眼球摘除后的处理与冷冻切片过程，切片沿背侧-腹侧轴进行。粉色阴影区域（右图）显示使用该技术后蛋白敲降程度最高的视网膜区域。蓝色阴影区域代表电穿孔操作中最常受损的部位。眼球的方向标注为前侧（A）、后侧（P）、背侧（D）和腹侧（V）。

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</ol>

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最近，两项微阵列分析研究了光损伤视网膜或手术切除视网膜区域后发生的基因表达变化10, 16。这两项研究均发现了大量表达发生显著变化的基因，这些基因的表达水平或升高或降低，可能参与视网膜再生过程中的不同事件，例如穆勒胶质细胞重新进入细胞周期、神经前体细胞持续增殖并迁移至受损的视网膜层，以及神经前体细胞分化为正确的神经元细胞类型。尽管对这两项微阵列数据集进行直接比较可鉴定出可能参与上述细胞事件的候选基因，但最终仍需对这些基因及其编码的蛋白质进行功能验证，以确定其是否为神经元再生所必需。本文中，我们描述了一种强大的条件性功能缺失方法，可在成年斑马鱼视网膜中特异性敲低目标蛋白质。该技术已被用于研究细胞外和细胞内蛋白质、信号分子、转录因子以及DNA复制所必需的蛋白质17-19。因此，该方法极大地促进了我们对斑马鱼成年视网膜再生分子机制的理解。
		我们测试了多种电穿孔参数（电压、脉冲次数、脉冲间隔时间），最终建立了成功的实验方案。此前有文献报道，在对再生的斑马鱼尾鳍电穿孔导入吗啉代寡核苷酸时，采用的是10次低电压（15 V）脉冲 20由于成年斑马鱼视网膜被多层细胞包裹，难以通过镊子电极直接接触，因此在鳍部使用的参数无法有效将吗啉寡聚体电穿孔导入成年斑马鱼视网膜。相反，高电压（100 V）常导致鱼类死亡。最近有研究报道，采用5次80 V电脉冲可将质粒DNA电穿孔导入新生小鼠视网膜 21我们发现，采用稍低强度的两脉冲75 V电穿孔参数，可成功将morpholino导入成年斑马鱼视网膜，且处理后的鱼类存活率达到100%。此外，我们发现去除角膜最外层（或最表层）结构可显著提高电穿孔效率。增加脉冲次数可能无需去除该组织，但也可能造成更严重的组织损伤。大量对照实验表明，这些参数不会引起明显的视网膜细胞死亡，也不会改变光感受器再生过程中所观察到的特定细胞反应。 19目前无法使用该技术进行功能获得性研究 体内，由于我们无法稳定地将大分子核糖核酸电穿孔导入所有视网膜细胞。然而，将质粒电穿孔导入小鼠视网膜的成功率较高 体内 斑马鱼离体视网膜的实验结果表明，这种情况在斑马鱼中仍有可能发生 21, 22.
		该技术的优点之一是电穿孔能够高效地将吗啉寡聚核苷酸导入视网膜中所有不同类型的细胞。然而，一个潜在的局限性在于，电穿孔仅能高效地将吗啉寡聚核苷酸递送至视网膜的背侧和中央区域。若对视网膜腹侧区域进行第二次电穿孔，虽可实现对所有视网膜层的良好靶向，但常导致组织损伤。这种空间上的限制可能与电极的形状和放置位置有关。使用专门设计的杯状电极并将其环绕于眼球周围，可能有助于改善这一缺陷。这种吗啉寡聚核苷酸递送的空间局限性限制了该技术的应用，使其无法用于需要对整个视网膜进行全局评估的实验，例如视网膜电图（ERG）分析。需要注意的是，与所有吗啉寡聚核苷酸实验一样，建议使用第二个不重叠的吗啉寡聚核苷酸靶向目标mRNA，以验证实验结果。在某些情况下，也可同时电穿孔两种不同的吗啉寡聚核苷酸，以同时抑制两种不同蛋白质的表达。我们已通过单独及联合敲低Pax6a和Pax6b蛋白的表达对此进行了验证18。
		尽管我们在此以光损伤模型展示了该技术的应用，但它也可能用于研究其他损伤模型中的再生过程2-8，或用于检测蛋白质在未受损视网膜中的功能。例如，可通过电穿孔导入吗啉代寡核苷酸（morpholinos）以抑制特定通道或信号转导分子在节细胞或无长突细胞中的表达，进而研究这些信号通路在视觉信息处理中的作用。然而，由于吗啉代寡核苷酸仅影响新蛋白质的翻译，因此必须等待内源性蛋白质完成自然降解后才能进行功能检测。根据蛋白质稳定性的不同，这一过程可能需要数小时至数天不等18。

<table><tbody><tr><td>CUY21-EDIT 或 CUY21-SC 方波电穿孔仪</td><td>Protech International, Inc.</td><td>CUY21EDIT 或 CUY21SC</td><td>两种设备均适用于本实验方案</td></tr><tr><td>3 mm 直径板状电极</td><td>Protech International, Inc.</td><td>CUY 650-P3</td><td> </td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>GeneTools, LLC</td><td></td><td>Morpholino 应根据目标蛋白进行定制设计</td></tr><tr><td>2-苯氧乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77861-1L</td><td>麻醉剂；实验过程中用鱼系统水按 1:1000 稀释，安乐死时按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14095</td><td>任何品牌的 #5 镊子均可使用</td></tr><tr><td>尖端弯曲的 Dumont #5B 镊子</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500234</td><td>用于动物安乐死后摘除眼球</td></tr><tr><td>双刃矛形蓝宝石刀片，宽 1 mm，配蓝宝石刀柄</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>刀片：500314 刀柄：500317</td><td> </td></tr><tr><td>可拆卸 33 号钝头针头的 Hamilton 注射器</td><td>Hamilton Co</td><td>注射器：87930 针头：7762-06</td><td>移除注射器自带的针头，更换为 33 号钝头针头</td></tr></tbody></table>

体内电穿孔法将吗啉代寡核苷酸导入成年斑马鱼视网膜

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

许多严重的遗传性眼病会导致进行性且不可逆的失明，因为人类无法再生死亡或病变的视网膜神经元。相比之下，成年斑马鱼的视网膜具有强大的自我再生能力，能够在多种视网膜损伤模型（包括视网膜穿刺、化学消融、高温处理和强光照射）中再生任何丢失的神经元类型1-8。本实验室已深入表征了在持续强光照射后光感受器的再生过程，以及玻璃体内注射哇巴因后内层视网膜神经元的再生2, 5, 9。在所有这些情况下，视网膜内的穆勒胶质细胞均会重新进入细胞周期，产生神经前体细胞，这些前体细胞继续增殖并迁移至相应的视网膜层，最终分化为缺失的神经元。
	在光损伤视网膜再生过程中，我们鉴定了五个不同的阶段，各阶段以特定的细胞反应为特征。通过mRNA微阵列分析10，我们鉴定了每个视网膜再生阶段中差异表达的多个基因。其中许多基因在眼部发育过程中也具有关键作用。为了验证每个候选基因/蛋白质在视网膜再生过程中的功能，我们需要建立一种方法，能够在成年视网膜再生的特定时期条件性地抑制候选蛋白的表达。
	吗啉代寡核苷酸被广泛用于研究斑马鱼、Xenopus、鸡、小鼠以及人源异种移植肿瘤发育过程中特定蛋白质的功能缺失11-14。这些修饰的寡核苷酸通过与互补的RNA序列碱基配对，阻断目标RNA的剪接或翻译过程。吗啉代寡核苷酸在细胞内具有稳定性，可使蛋白质表达降低或“敲低”三至五天12。
	本文介绍一种在成年斑马鱼视网膜中高效敲低目标蛋白表达的方法。该方法采用罗丹明标记的反义吗啉环寡核苷酸，将其注射至成年斑马鱼眼球的玻璃体内。随后使用电极镊子，将吗啉环寡核苷酸电穿孔导入背侧和中央视网膜的所有细胞类型中。罗丹明为吗啉环寡核苷酸提供电穿孔所需的电荷，并可通过荧光观察以评估吗啉环寡核苷酸在视网膜细胞中的存在情况。
	在视网膜中进行条件性基因敲低可用于研究特定蛋白质在再生过程中不同时期的作用。此外，该方法还可用于研究特定蛋白质在未受损视网膜中的功能，例如在视觉转导以及二级神经元的视觉信息处理等过程中的作用。

本文介绍了一种在成年斑马鱼视网膜中条件性敲低目标蛋白表达的方法，该方法包括将反义吗啉环寡核苷酸（morpholinos）玻璃体内注射并电穿孔导入视网膜。该方法可使目标蛋白表达在数天内被敲低，从而可用于研究该蛋白在再生或完整视网膜中的功能。

许多严重的遗传性眼病会导致视网膜细胞进行性退化和不可逆失明，因为人类无法再生死亡或病变的视网膜……

本实验的总体目标是在成年斑马鱼视网膜中抑制或敲低特定蛋白的表达。首先通过去除鱼眼的外层角膜，随后在内层角膜上制造一个小孔来实现这一目标。然后将基因特异性的吗啉代寡核苷酸注入玻璃体。最后，通过电穿孔将吗啉代寡核苷酸导入视网膜细胞。最终，可通过视网膜组织切片的免疫荧光显微镜检测或免疫印迹实验，获得显示靶蛋白表达水平降低的结果。该技术的应用前景涉及视网膜变性疾病的治疗，例如视网膜色素变性。由于该方法有助于阐明穆勒胶质细胞在受损视网膜中增殖的潜在机制，我们或许能够找到诱导人类视网膜损伤后产生类似反应的方法。尽管该技术主要用于研究成年斑马鱼视网膜的再生过程，但稍加改进后也可用于研究视网膜中的其他过程，例如特定蛋白质在光信号转导或视觉信息处理中的作用。演示由Ryan Tummel博士在博士后期间开发的实验步骤。在我实验室中协助演示的是现任博士后Travis Bailey。在处理鱼类之前，需准备带正电荷的丽丝胺标记的Morpho，可通过将300 NMO的Morpho稀释至100微升无核酸酶水中，配制成三毫摩尔浓度的溶液。为了去除角膜外层，使用浓度为每毫升1毫克的三卡因（trica）或在斑马鱼养殖用水中加入2%乙醇，对6至12月龄的斑马鱼进行麻醉。将斑马鱼包裹在湿润的纸巾中，覆盖其鳃部，但暴露眼睛。将包裹好的鱼置于体视显微镜下，并增加放大倍数，使眼睛的直径约占视野的三分之一。接着，使用Dumont 5号镊子，在视裂附近略为突出或呈唇状的部位夹住角膜外层，以防止眼睛脱落。去除角膜时，用另一把镊子固定角膜。然后以较低角度沿眼球表面牵拉，以完整取下角膜。在外层角膜去除后，立即使用蓝宝石刀片手术刀，在瞳孔与虹膜交界处的角膜上做一个小切口。将0.5 µL的形态学溶液吸入一支配有33号可拆卸钝头针头的汉密尔顿注射器中。反复吹吸以排除管路中的气泡。通过切口小心地将针头插入玻璃体。切勿将针头插入过深，以免刺穿视网膜或导致晶状体移位。缓慢将吗啡溶液注入玻璃体腔。随着吗啡溶液的注入，无色的玻璃体将从切口处溢出。注射至少量形态剂从切口处渗出为止。眼内应清晰可见带丽丝胺标记的莫里诺。注射完成后，将鱼放回水箱恢复，以另一只未注射的眼作为对照。设置电穿孔参数为连续两个50毫秒脉冲，电压75伏。在注射约10条鱼后，每次脉冲之间间隔1秒。将已注射的鱼重新麻醉，并用湿润的纸巾包裹，毛巾仅覆盖鳃部，但保留眼睛暴露。将鱼转移至盛有麻醉剂的培养皿中。戴手套的手轻轻将鱼按在充满麻醉剂的培养皿底部，注意完全浸没鱼眼。为靶向背侧视网膜，将正极电极轻轻向下压在眼球的腹侧半部，使眼球旋转并暴露眼球的背侧部分；在持续按压腹侧的同时，将负极电极置于距离暴露的背侧半部眼球0.5至1毫米处。避免将负极电极直接放置在眼睛上，否则会损伤背侧视网膜。确定电极间合适距离后，调节电极手柄上的螺丝，以保持后续电穿孔过程中电极间距恒定。完成电穿孔后，将鱼立即放回盛有新鲜养殖水的水族箱中复苏，并随即对鱼实施可引起视网膜基因表达变化的实验操作，例如持续光照诱导的视网膜变性。当视网膜沿背腹轴从鼻侧向颞侧切片时，蓝色阴影区域代表最常因电穿孔操作本身而受损的视网膜区域。粉色阴影区域代表电穿孔旨在将形态物质导入视网膜细胞的目标区域。如右侧图像所示，在电穿孔后三天，罗丹明标记仍在切片视网膜的所有层和细胞类型中可见，包括视杆细胞外段、外核层、内核层以及神经节细胞层。左侧的空白图像来自未注射的对照眼，其中缺乏任何丽丝胺标记的吗啉代寡核苷酸。在电穿孔后三至五天内可实现目标蛋白的完全敲低，具体时间取决于吗啉代寡核苷酸的效率。在本示例中，将阴性对照吗啉代寡核苷酸（即 A-P-C-N-A 吗啉代）电穿孔至视网膜中，并在光照暴露一天、两天或三天后取出视网膜组织，随后对组织进行处理并使用抗 PCNA 抗体进行免疫染色。在所有三个对照组视网膜中均观察到大量 PCNA 阳性细胞（绿色），但在吗啉代处理的视网膜中，PCNA 表达显著降低。掌握该技术后，你应该能够在一小时内对约 20 条鱼完成此操作。在进行该操作时，需注意切勿将电极直接接触鱼眼。其他方法，如免疫组织化学、原位杂交、实时 PCR 和免疫印迹，可用于回答更多问题，例如哪些遗传通路在视网膜再生过程中是必需的。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在体内电穿孔Morpholinos到成年斑马鱼视网膜

已建立一种在受精后24小时（24hpf）将吗啉代寡核苷酸直接递送至斑马鱼耳囊的方法。通过将吗啉代寡核苷酸微量注射至听泡腔内，并结合电穿孔促进其穿透，我们能够避免吗啉代寡核苷酸对脑部的影响，从而获得特异性作用于内耳的效果。...

通过显微注射与电穿孔将MIF Morpholino直接递送至斑马鱼耳囊影响内耳发育

一种将质粒DNA导入小鼠视网膜细胞以开展功能获得或功能缺失研究的方法 体内...

体内 电穿孔转染发育中小鼠视网膜

我们介绍一种在成年斑马鱼鳍再生过程中条件性敲低目标蛋白表达的方法。该技术包括将反义寡核苷酸吗啉代通过显微注射并电穿孔导入鳍组织，从而可在鳍再生的各个阶段（包括伤口愈合、芽基形成和再生性生长）中检测该蛋白的功能作用。...

体内电穿孔法将吗啉寡核苷酸导入再生的成年斑马鱼尾鳍

本方案通过在斑马鱼尾部注射吗啉代寡核苷酸，实现对基因表达的靶向敲低。...

吗啉代注射：一种在斑马鱼中敲低目标基因表达以研究其功能的方法

体内电穿孔：一种用于斑马鱼定点转染的方法

本文介绍了一种利用反义吗啉环寡核苷酸在成年斑马鱼端脑室管膜细胞中调控基因表达的方法。我们提出该方法是一种高效且快速的实验方案，可用于成年脊椎动物脑部的功能研究。...

利用吗啉代寡核苷酸脑室微量注射技术对成年斑马鱼大脑进行基因表达的微操作

我们介绍一种利用显微操作和视网膜电图（ERG）技术对斑马鱼幼鱼进行视网膜电图分析的方法。该方法简便直接，适用于检测斑马鱼幼鱼的视觉功能。 体内.

斑马鱼幼鱼视觉反应的视网膜电图分析

斑马鱼视网膜再生的研究主要采用固定视网膜组织进行。然而，再生反应过程中会发生诸如核间期迁移（INM）等动态过程，这些过程需要通过活细胞成像来探究其潜在机制。本文中，我们描述了利用多光子显微镜实时监测核间期迁移（INM）的培养与成像条件。...

成年转基因斑马鱼视网膜外植体的培养及其通过多光子显微镜进行的活细胞成像

本文介绍了一种用于在成年斑马鱼端脑中递送质粒DNA并标记室管膜胶质细胞的电穿孔方法。该方案是一种快速高效地观察和示踪单个室管膜胶质细胞的技术，为将电穿孔技术应用于广泛的遗传操作提供了新的可能性。...

成年斑马鱼端脑内质粒DNA体内递送的电穿孔方法

本文介绍一种对斑马鱼胚胎大脑进行活体成像的方法，可观察至幼虫期和稚鱼期。该方法借鉴电生理学技术，属于微创操作，能够获取成熟神经元的细胞及亚细胞结构细节，并可与光遗传学及神经药理学研究相结合，用于表征脑功能及药物干预效果。...

通过去除头骨和皮肤实现清醒斑马鱼幼虫和幼鱼全脑组织的活体成像

本文介绍了如何通过手术从活体斑马鱼幼体中摘除眼球，作为研究视网膜输入如何影响视顶盖生长与发育的第一步。此外，本文还提供了幼体麻醉、固定和脑组织解剖的方法，并进一步介绍了免疫组织化学染色和共聚焦成像技术。...

活体斑马鱼幼鱼眼球摘除以研究视觉系统发育和生长对神经支配的依赖性

学习利用电穿孔技术将Morpholinos导入成年斑马鱼视网膜的方法，实现特定蛋白的条件性敲低。该技术结合玻璃体腔注射与电穿孔，为研究视网膜再生机制及视网膜退行性疾病治疗策略提供重要工具。

体内电穿孔法将吗啉代寡核苷酸导入成年斑马鱼视网膜

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