Name: 体外拟态正常与异常的人造血 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 学习利用聚氨酯支架与细胞外基质蛋白涂层构建三维造血培养系统，用于研究人脐带血单核细胞及白血病细胞的生长行为。该模型无需外源细胞因子即可支持细胞增殖，为血液疾病治疗研究提供重要实验平台。

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本工作由理查德·托马斯白血病基金、塔塔夫人纪念信托基金、诺斯威克公园医院白血病研究信托基金以及英国国家卫生研究所（NIHR）资助。

1. 支架的制备与支架的生物功能化
<ol>
 <li>采用热致相分离法13制备呈培养皿圆片状的聚氨酯（PU）支架（孔径100–250 mm，孔隙率90–95%），具体步骤为：配制聚合物溶液（5 wt%溶于二氧六环），随后进行冷冻及溶剂升华（图1A）。</li>
 <li>在用细胞外基质（ECM）蛋白包被前，将支架圆片切割成0.5 × 0.5 × 0.5 mm的立方体（图1B）。</li>
 <li>通过将支架浸入70%乙醇中1分钟进行预润湿，然后转移至磷酸盐缓冲液（PBS）中20分钟。随后在3630 × g下离心10分钟，并加入蛋白溶液。</li>
 <li>将支架在蛋白溶液中以1420 × g离心20分钟。</li>
 <li>为打开表面孔隙并促进接种细胞向支架内部更深层渗透，将支架在PBS中以910 × g再离心一次，持续10分钟。</li>
 <li>采用以下组合方式对支架进行灭菌：在230 V、50 Hz、0.14 A条件下使用紫外灯照射8分钟，并浸入70%乙醇中2小时。随后用PBS洗涤两次，再加入添加了30%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的Iscove改良杜尔贝科培养基（IMDM）。将支架置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育3天，之后使用。灭菌后的支架置于24孔组织培养板中（每孔放置一个支架）。</li>
</ol>
2. 单个核细胞分离与支架接种
<ol>
 <li>采用 Ficoll-Paque 密度梯度离心法（1500 rpm，35 分钟）从脐带血或白血病骨髓样本中分离人单个核细胞（MNC）（图 1C）。</li>
 <li>将 MNC 重悬于含 30% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素（P/S）的 IMDM 培养基中。</li>
 <li>使用微量移液器将 100 μl MNC 悬液（每支架 2 × 106 个细胞）接种至支架上。</li>
 <li>将接种后的支架置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 10 分钟，使细胞沉降并进入支架内部。</li>
 <li>每孔补充 1.5 ml 含 30% FBS 和 1% P/S 的 IMDM 培养基，并将培养板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中持续培养至实验结束。</li>
 <li>接种后的支架需每日更换全部培养基。</li>
</ol>
3. 原位 细胞增殖与形态学：MTS、SEM 及细胞离心涂片
<ol>
 <li>MTS 检测：从培养物中取出一个未接种细胞的支架和两个已接种细胞的支架，放入新的洁净24孔板中。每孔加入1 ml培养基和200 μl MTS溶液，在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。
 <ol>
 <li>从上清液中取8份100 μl样品，加入96孔板中，使用酶标仪在490 nm波长下测定吸光度。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>扫描电子显微镜（SEM）：在培养的不同时间点，将接种了单个核细胞（MNC）的支架从培养基中取出，用2.5% PBS缓冲的戊二醛溶液在4 °C下固定40分钟，然后用PBS洗涤两次。
 <ol>
 <li>将支架依次在浓度梯度为25%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇中脱水，每次10分钟，随后在无菌环境中干燥4小时。</li>
 <li>对样品进行切片处理，然后在氩气环境中溅射镀金2分钟，再进行SEM观察，使用20 kV的加速电压。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>细胞离心涂片（Cytospins）：在培养的不同时间点，从支架上吸取细胞，每张载玻片收集2.0 × 104个细胞。
 <ol>
 <li>将细胞以1500 rpm离心3分钟，沉积到玻璃载玻片上。</li>
 <li>用改良的瑞氏-吉姆萨染液对载玻片染色，并使用光学显微镜观察。可使用F-view Soft Imaging System拍摄图像。</li>
 <li>在显微镜观察前清洗载玻片。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>多光子分析：在不同培养时间点，用70%乙醇蒸气固定支架，过夜，然后干燥并保存于-20 °C，待进一步分析。在使用多光子显微镜观察前，将支架切成30 μm厚的切片，并用PBS润湿。
 <ol>
 <li>用含10%胎牛血清的PBS在室温下封闭已接种细胞的支架30分钟。</li>
 <li>在4 °C避光条件下，用1:50稀释的一抗（小鼠抗人CD71单克隆抗体）孵育支架过夜。</li>
 <li>用PBS洗涤样品三次，然后在室温避光条件下，用二抗（抗小鼠Alexa Fluor 488）染色1小时。</li>
 <li>用PBS洗涤样品三次，使用共聚焦显微镜配合水浸x60物镜进行观察。</li>
 <li>荧光染料Alexa Fluor 488由脉冲激光在488 nm激发。后续图像分析可使用Volocity 5.3.2软件完成。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. 细胞群体的流式细胞术分析
<ol>
 <li>在使用流式细胞仪（FC）进行细胞分析之前，使用相应的免疫荧光抗体标记目标细胞以进行检测。根据所选的检测抗体，制备多个样本。用于单个核细胞（MNC）检测的抗体组合如下：CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5。</li>
 <li>在不同时间点从支架中吸出细胞并离心。将约含1×106个细胞的细胞沉淀溶解于100 μl FC缓冲液（PBS + 0.1%叠氮化钠）中，并加入每种荧光标记抗体各10 μL。在4 °C孵育30分钟，用PBS洗涤两次，最后重悬于FC缓冲液中。</li>
 <li>将使用同型对照抗体染色的样本上机至流式细胞仪，以设定抗体表达的“阴性”阈值，并使用流式细胞仪对照校准检测通道。</li>
 <li>检测经三种不同抗体染色的样本，最终使用WinList软件进行数据分析与呈现。</li>
</ol>
5. 代表性结果
在未添加外源性生长因子的情况下，造血细胞生长动力学的一个示例如图2所示。由于造血过程具有异质性，图中展示了两种不同的细胞：正常与异常造血细胞。图2A显示，人脐血单个核细胞（CBMNC）在培养28天后出现明显的细胞增殖。图2B展示了利用人原代白血病细胞进行模拟时的生长动力学。细胞增殖通过MTS法进行评估，该方法通过吸光度测定细胞代谢活性。在两种情况下，细胞均实现了增殖并在模型中成功建立。观察到生长动力学存在差异：正常造血细胞比白血病细胞更快地建立培养体系。
收获的细胞在无外源性生长因子的条件下培养28天后，其形态仍具有正常造血细胞的典型特征（图 3A）和白血病细胞（图3B）。取出支架后，通过扫描电镜分析支架的中心区域，结果显示接种的细胞在支架内广泛分布，形成簇状及“类生态位”结构。图 3A' &amp;B'). 图C 显示了作为对照组的未接种细胞支架中的孔径大小与分布。通过28天后的多光子显微镜观察，突出显示细胞在三维支架内的分布情况。 原位 并显示支架中央区域存在红细胞岛（图4通过红系前体细胞中标志物CD71的表达对其进行鉴定，CD71在成红血细胞中呈阳性。这证明了成熟及正在成熟的细胞在红细胞生成过程中的重要性。最后，接种前细胞的流式细胞术图谱显示了造血细胞表型的差异，其中 图5A 代表正常的造血细胞：人脐带血单个核细胞（CBMNCs）和 图 5B 展示异常造血细胞：原代白血病细胞。CD235a 水平 + 和 CD45+ 分别对应红细胞和白细胞的信号在正常样本中高于白血病样本，突显了白血病的造血细胞恶性增殖特性。
<img alt="聚氨酯支架合成与细胞接种过程；包含TIPS和细胞外基质蛋白包被的示意图。" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 聚氨酯（PU）支架制备及生物功能化过程示意图。A) 将聚氨酯溶解于二噁烷（5 wt%）中，通过热致相分离法（TIPS）及后续溶剂升华过程制备支架，方法如Safinia et al13 所述。B) 将支架圆片切割成 0.5 × 0.5 × 0.5 mm 的立方体，随后通过离心法包被细胞外基质（ECM）蛋白。C) 利用密度梯度离心法从人脐带血（CB）或骨髓（BM）穿刺液中分离单个核细胞（MNC），并通过微量移液器将细胞接种至PU支架中（每支架 2×106 个细胞）。
<img alt="数天内的吸光度；柱状图；A/B样本；490 nm处的吸光度；时间依赖性分析。" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 采用MTS法测定细胞增殖：A）使用人脐带血单个核细胞；B）使用人原代白血病细胞。各柱状图显示了细胞在PU支架中接种后，在未添加外源性细胞因子条件下随时间的生长情况。
<img alt="细胞分析、显微镜图像、扫描电镜和光学显微照片、细胞结构检查、实验室设置。" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3">
图3：通过细胞离心涂片和扫描电镜观察细胞在支架周围的形态及分布情况。（A-B）A）培养28天后从聚氨酯（PU）支架上收集的脐带血单个核细胞的代表性Wright-Giemsa染色细胞离心涂片，以及B）培养14天后从PU支架上收集的骨髓穿刺获得的白血病细胞的代表性Wright-Giemsa染色细胞离心涂片。两个实验均在无细胞因子条件下进行。（A'-B'）A'）接种的脐带血单个核细胞和B'）白血病细胞在PU支架上培养28天后的代表性中央断面扫描电镜图像，以及C）未接种细胞的空白对照支架。
<img alt="骨微结构分析；三维重建；CT扫描；小梁网络；结构完整性评估。" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4">
图4. 聚氨酯支架接种脐带血单个核细胞培养28天后，经红系标志物CD71染色的多光子显微图像。
<img alt="流式细胞术散点图、细胞群体分化、CD标志物可视化、实验结果。" src="/files/ftp_upload/3654/3654fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 针对 CD45、CD71 和 CD235a 表面表达标志物染色的流式细胞术三维点图。同时展示了同型对照，用于比较相对荧光强度。图 A 显示表达上述标志物的人脐带血单个核细胞；图 B 显示人原代白血病细胞。

<ol><li>Orkin, S., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Spradling, A., Drummond-Barbosa, D., Kai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+find+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells find their niche.</a> Nature. 414, 98-104 (2001).</li>
<li>Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+mimicry+of+bone+marrow+tissue+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo.</a> J Biosci. Bioeng. 100, 28-35 (2005).</li>
<li>Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li>
<li>Mantalaris, A., Bourne, P., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+osteoclasts+in+a+three-dimensional+bone+marrow+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Eng.+J%22%5BJournal%5D)">Production of human osteoclasts in a three-dimensional bone marrow culture system.</a> Biochem. Eng. J. 20, 189-196 (2004).</li>
<li>Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+bioprocessing%3A+fundamentals+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Stem cell bioprocessing: fundamentals and principles.</a> J. R. Soc. Interface. 6, 209-232 (2009).</li>
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<li>Yoshida, T., Takagi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+processing+engineering+for+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+cells%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell processing engineering for ex vivo expansion of hematopoietic cells: a review.</a> Biochemical Engineering Journal. 20, 99-106 (2004).</li>
<li>Lim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intelligent+bioprocessing+for+haemotopoietic+cell+cultures+using+monitoring+and+design+of+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Intelligent bioprocessing for haemotopoietic cell cultures using monitoring and design of experiments.</a> Biotechnol. Adv. 25, 353-368 (2007).</li>
<li>Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Panoskaltsis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+three-dimensional+scaffold+for+ex+vivo+biomimicry+of+human+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The development of a three-dimensional scaffold for ex vivo biomimicry of human acute myeloid leukaemia.</a> Biomaterials. 31, 2243-2251 (2010).</li>
<li>Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Aqel, N., Panoskaltsis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cytokine-free+expansion+of+cord+blood+mononuclear+cells+in+three-dimensional+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term cytokine-free expansion of cord blood mononuclear cells in three-dimensional scaffolds.</a> Biomaterials. 32, 9263-9270 (2011).</li>
<li>Safinia, L., Datan, N., Hohse, M., Mantalaris, A., Bismarck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+methodology+for+the+effective+surface+modification+of+porous+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Towards a methodology for the effective surface modification of porous polymer scaffolds.</a> Biomaterials. 26, 7537-7547 (2005).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

本文介绍的ex vivo三维培养系统可构建出模拟造血过程的三维生物模型，该模型能够在不依赖外源性细胞因子的条件下重现原始骨髓（BM）的结构架构和细胞表型。该三维模型提供了相应的结构和微环境，使正常与异常的造血细胞能够在类似于体内（in vivo）的条件下增殖。
聚合物支架材料的选择是仿生设计中的关键步骤。生物材料领域的重要优势使得人们对模拟天然结构的聚合物的兴趣日益增加 体内 通过提供所需的结构架构、物理特性和必要的生物信号，为细胞生长创造适宜的微环境。聚合物必须满足其在生物医学应用中的最低要求，因为它们始终与活细胞直接接触，而细胞对其周围微环境高度敏感。一般来说，理想的支架应具备生物相容性、高度多孔性、足够的机械强度以维持特定的三维结构、较高的比表面积，并可重复制备。聚氨酯（PU）具备上述全部特性，其中高孔隙率和机械强度可根据热致相分离（TIPS）过程中的淬冷温度进行调节和改变。因此，通过按需增加或减小孔隙率和孔径，该仿生支架可适用于其他类型的细胞。
本实验中的支架已...

<table><tbody><tr><td>二噁烷</td><td>Invitrogen</td><td>D20,186-3</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Invitrogen</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>MTS</td><td>Promega Corp.</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Fluka</td><td>49624</td><td></td></tr><tr><td>瑞氏-吉姆萨染液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WG32</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10108-165</td><td></td></tr><tr><td>CD71</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-32272</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>74895</td><td></td></tr><tr><td>CD71-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555537</td><td></td></tr><tr><td>CD235a-PE-Cy5</td><td>BD Biosciences</td><td>555570</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo 模拟正常与异常的人类造血过程

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

造血干细胞需要独特的微环境以维持血细胞的生成1骨髓（BM）是一种复杂的三维（3D）组织，其中造血作用由空间有序排列的细胞微环境（称为niche）进行调控。2-4骨髓微环境的结构对于正常或恶性骨髓的功能或功能障碍至关重要5因此，对 体内 微环境，使用一种 离体 模拟将有助于我们阐明白血病发生的分子、细胞及微环境决定因素6.
目前，造血细胞的培养 体外 在二维（2D）组织培养瓶/孔板中7 需要与同种异体或异种基质细胞共培养，或添加外源性细胞因子8这些条件是人为设定的，与自然状态不同 体内 微环境，因为它们缺乏三维细胞生态位，并使细胞暴露于异常高的细胞因子浓度下，这可能导致细胞分化和多能性的丧失9,10.
在此，我们介绍一种模拟骨髓微环境的新型三维骨髓培养系统 体内 三维生长环境可在无外源生长因子的条件下支持多谱系造血。该系统所用的高孔隙率聚氨酯（PU）支架，相较于传统的二维单层培养，可在更高的比表面积上实现高密度细胞生长。11我们的研究结果表明，该模型支持人脐带血（CB）单个核细胞（MNC）的生长12 在无外源性细胞因子的情况下，支持原代白血病细胞的生长。这种新型三维模拟系统为建立研究造血过程及探索白血病新疗法的人体实验模型提供了可行的平台。

本文描述了一种利用人脐带血和白血病骨髓细胞进行造血的三维培养系统。该方法基于使用涂覆有细胞外基质蛋白的多孔合成聚氨酯支架。该支架可适应多种细胞的培养。

造血干细胞需要一种独特的微环境以维持血细胞的生成1；骨髓（BM）是一种复杂的三维结构……

以下实验的总体目标是构建一种体外模型，以模拟正常和异常的造血过程。该模型通过热致相分离技术（TIPS）制备聚氨酯支架实现，该技术可生成一种高度多孔、不可降解的培养皿形态支架。随后，将支架切割成小立方体，并包被细胞外基质蛋白，以促进细胞黏附。在接种细胞前，支架需经紫外线和乙醇灭菌处理，并在培养基中孵育至接种时使用。下一步是从脐血样本中分离单个核细胞，用于接种支架。研究结果表明，根据M-T-S-S-E-M和流式细胞术检测的数据，该模型可在无外源性细胞因子的条件下支持人脐血单个核细胞及原代白血病细胞的生长。该方法有助于解决皮肤科学领域的一些关键问题，例如构建骨髓的实验模型以研究细胞间相互作用，并探索新的治疗方法。在白血病研究中，尽管该方法能够提供骨髓的体外生物模拟环境，但它也可应用于其他系统，例如神经元细胞，用于体外重建神经元网络，以此作为理解神经元自然生长过程的模型，并用于研究神经系统疾病。该技术的应用前景还包括血液相关疾病的治疗，如白血病，因为可以在类似于人体内部的环境中测试不同药物对其治疗的效果。为了制备直径为90毫米的培养皿状聚氨酯（PU）支架，采用热致相分离法。每个支架大致配制60毫米的聚合物溶液。将溶液倒入深度为0.5厘米的培养皿模具中，冷冻模具并使溶剂升华。冷冻后安装尖端设备，将支架圆片切成 0.5 厘米的立方体。通过将支架立方体浸入 70% 乙醇中 1 分钟进行预处理，然后转移至 PBS 中浸泡 20 分钟。PBS 处理后，将 20 个立方体装入 50 毫升锥形管中，并对支架进行离心。接下来，向每个锥形瓶中加入 40 毫升 ECM 蛋白溶液，并再次进行离心。然后去除蛋白溶液，向每个锥形瓶中加入 40 毫升 PBS，再进行一次离心。随后将支架小块转移至 24 孔组织培养板中，每孔放置一个支架以进行灭菌处理，先暴露于紫外光下照射 8 分钟，之后浸入 70% 乙醇中 2 小时。用 PBS 清洗支架两次，然后将其浸入添加补充物的 IMDM 中。将支架存放在培养箱中，直至接种细胞。当支架准备就绪后，从脐带血或白血病骨髓样本中分离人单个核细胞（MNCs）。从不透明的密度梯度开始。将组织在50毫升锥形管中进行离心。从悬浮液中收集单个核细胞（MNCs）。然后计数细胞并重悬，将每100微升溶液中含有200万个细胞的MNCs悬液接种到每个支架上。将接种后的支架孵育10分钟，使细胞沉降到支架中。10分钟后，向每孔加入额外的1.5毫升添加补充物的IMDM培养基，并将培养板放回孵箱。在实验期间，每天更换全部培养基。MTS 检测通过吸光度来测定细胞代谢活性。取一个未接种细胞的支架和两个已接种细胞的支架，置于24孔板中，每孔加入1毫升培养基和200微升 MTS 溶液。将培养板在37摄氏度下孵育3小时。随后，从上清液中转移100微升样品至96孔板的八个孔中。通过在490纳米处测定吸光度来完成检测。在不同的培养时间点，使用酶标仪取出一个载有单个核细胞（MNCs）的支架。用于扫描电镜（SEM）分析时，在4°C条件下，用2.5% PBS缓冲的戊二醛溶液固定支架40分钟。随后用PBS洗涤两次以去除固定液，再将支架置于梯度乙醇系列中进行脱水，每次浸入乙醇溶液中持续10分钟。将样品从100%乙醇中取出，在室温下干燥四小时。然后使用支架手动切片，确保支架的孔隙朝上。将切好的样品片固定在金属支架上的玻璃表面，用于扫描电镜观察。然后用金溅射涂覆载玻片，为在不同时间点对细胞甩片进行扫描电镜评估做准备。从培养环境中取出支架，并吸取细胞样本用于细胞学检查。确保尽可能吸除支架孔隙中的全部培养基。采用标准的细胞离心涂片固定技术后，使用改良的瑞氏-吉姆萨染液对玻片进行染色，染色持续六秒，随后用蒸馏水冲洗10分钟，并在不同时间点于显微镜下观察。孵育期间。取出已接种的支架，用乙醇蒸气固定过夜。次日，将固定后的支架风干，并冷冻保存，直至收集完所有所需时间点的支架样本。用于分析时，将每个支架切成30微米的固定切片，并将切片载于载玻片上以进行后续处理。在室温下用含10%胎牛血清的PBS封闭样本30分钟。然后将样本浸入1:50稀释的一抗单克隆抗体溶液中，于4°C避光孵育过夜。次日，用PBS洗涤样本三次，再用1:200稀释的二抗溶液染色1小时。在室温避光条件下，当孵育结束后，用 PBS 将样本上的抗体洗涤三次。使用水镜 60 倍物镜和 488 纳米激发波长，在共聚焦显微镜下观察载玻片，进行流式细胞术检测。在不同时间点，从接种了支架的培养物中吸取 250 微升细胞悬液，并离心沉淀。从支架中吸取细胞。这一操作并不容易，因为细胞已通过相互连通的孔隙进入支架内部。因此，为了尽可能获得活性良好的细胞，在尽量吸出内部培养基的同时，务必注意不要过度剧烈地处理细胞。支架。将细胞沉淀重悬于80微升FC缓冲液中，细胞密度应约为每毫升100万个细胞。向细胞悬液中加入10微升用于MNC检测的每种荧光染料标记的抗体。现在使用三种抗体的组合，在4°C避光孵育细胞30分钟。离心后，用一毫升PBS将冷却的细胞洗涤两次，最后将细胞重悬于一毫升FC缓冲液中。此时细胞已准备好进行流式细胞术分析。由于造血过程具有异质性，实验采用了两种不同类型的细胞。研究内容包括造血细胞的生长特性，以及正常与异常造血细胞的动力学。在无生长因子条件下培养仅七天后，通过MTS法检测细胞生长。人C-B-M-N-C细胞的细胞增殖现象明显，而人原代白血病细胞的生长则较缓慢。然而，两种细胞均能生长并提供了模型。培养28天后，通过细胞学和扫描电镜观察造血细胞和白血病细胞的形态。对支架的中央切片进行分析，结果显示接种的细胞在支架内广泛分布，以簇状及类似微环境的结构定植。在28天后，以未接种细胞支架中的孔径大小和分布作为对照。采用多光子显微镜原位观察细胞在三维支架内的分布情况。结果显示，在支架的中央区域存在红系岛，其依据是红系前体细胞表达CD71这一标志物。这证明了在红细胞生成过程中成熟及正在成熟的细胞的重要性。最后，接种前细胞的流式细胞术图显示造血细胞表型存在差异。正常样本中对应于红细胞的CD235A阳性以及对应于白细胞的CD45阳性水平均高于白血病样本。突出白血病的造血母细胞特性。在进行该操作时，重要的是要记住区分细胞贴壁的不同特性。提取细胞是该方案的关键步骤，某些细胞可能比其他细胞更易附着于支架上。尽量轻柔地吸取细胞，以保持较高的细胞活力。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建正常与异常造血的离体模型，包括支架的制备、灭菌、接种、培养收获，以及按照该操作流程对细胞进行最终分析。还可以进行其他金属检测，例如培养细胞产生的蛋白质的Western印迹分析，或细胞DNA的聚合酶链式反应，以回答其他问题，例如哪些类型的可溶性或细胞相关因子或基因参与了细胞外细胞的生长和分化。

ex-vivo-mimicry-of-normal-and-abnormal-human-hematopoiesis

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科研

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生物工程

体外拟态正常与异常的人造血

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人血液细胞集落形成细胞（CFC）检测

本文描述了一种从造血干细胞/祖细胞体外生成成熟人红细胞的 ex vivo 实验方案。此外，我们还介绍了一种高效的慢病毒递送方法，用于在原代红系细胞中敲低转录因子 TAL1。通过表达 GFP...

慢病毒介导的基因敲低过程 离体 人类造血干细胞的红细胞生成

本视频介绍了从髂嵴抽取骨髓以及制备涂片进行活检的技术。在示例中，我们对一名急性髓系白血病（AML）患者进行骨髓穿刺抽吸，并检查细胞以检测可测量残留病（MRD），后者是一种重要的预后生物标志物。...

骨髓穿刺：一种用于获取骨髓以检查细胞形态学的方法

造血干细胞与祖细胞（HSPCs）与骨髓微环境之间相互作用的性质尚不明确。通过定制的硬件改装和多步骤采集方案，可结合双光子显微镜与共聚焦显微镜进行成像 离体...

体内 成年小鼠颅骨骨髓中造血干细胞与祖细胞的四维追踪

本文介绍了一种对骨髓组织学数据进行定量分析的策略。通过对组织切片中荧光标记细胞进行共聚焦显微镜成像，获得二维图像，并对其进行自动分析。通过将不同细胞类型的共定位分析结果与模拟图像数据进行比较，可获得有关细胞间相互作用的定量信息。...

未脱钙骨组织切片中造血细胞与基质细胞相互作用的自动化定量分析

通过颅骨的活体荧光显微镜（IVFM）结合遗传性动物模型，用于研究造血细胞归巢并植入骨髓（BM）微环境的过程。...

结合活体荧光显微镜（IVFM）与遗传模型研究造血细胞向骨髓微环境植入的动态过程

本文介绍了一种在小鼠体内构建并进行活体成像不同类型人源化骨髓微环境的方法。该方法基于人源间充质细胞所构建的支持性微环境，通过添加人源内皮细胞可诱导形成人源血管，而添加重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）则可诱导形成人-鼠嵌合的成熟骨组织。...

人源化骨髓微环境的小鼠生物工程构建及其活体成像可视化

此处，我们介绍一种用于分析巨核细胞超微结构的实验方案 原位 采用透射电子显微镜（TEM）观察。收集小鼠骨髓，经固定、环氧树脂包埋后切成超薄切片。经对比染色后，在120 kV电压下用TEM显微镜观察骨髓结构。...

原位 探索小鼠巨核细胞生成过程——基于透射电子显微镜技术

在此，我们介绍一种易于实施、标准化的微生理系统，该系统能够反映人类骨髓的复杂性 体内...

用于研究生理或肿瘤环境下骨髓内细胞动态及其相互作用的人类骨髓三维模型

本文介绍了一种用于启动、维持和分析小鼠造血干细胞培养的实验方案 离体...

离体 基于聚乙烯醇培养体系的小鼠造血干细胞扩增与遗传操作

建立红细胞生成模型为理解该过程中各参与因子的生物学意义以及评估可能缓解分化缺陷的新型治疗策略提供了宝贵机会。本文介绍了一种简单且可靠的方法，可高效地将CD34+ 造血干细胞和祖细胞 离体.

体外与离体评估人类红细胞生成效率的综合性流程

学习利用聚氨酯支架与细胞外基质蛋白涂层构建三维造血培养系统，用于研究人脐带血单核细胞及白血病细胞的生长行为。该模型无需外源细胞因子即可支持细胞增殖，为血液疾病治疗研究提供重要实验平台。

ex vivo 模拟正常与异常的人类造血过程

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