这些模型在体外间皮间隙检测卵巢癌转移的早期步骤

这里描述的皮间隙检测，利用荧光标记的细胞和延时视频显微镜，可视化和定量测量卵巢癌多细胞球体和间皮细胞单层的相互作用。此法模拟卵巢癌转移的早期步骤。

该程序的总体目标是确定卵巢癌多细胞类固醇侵入间皮单层的能力。这是通过首先在低粘附培养板中孵育表达红色荧光蛋白的卵巢癌细胞以形成多细胞类固醇来实现的。下一步是将表达绿色荧光蛋白的间皮细胞接种在纤连蛋白包被的玻璃底培养皿上，以形成单层。

最后一步是将卵巢癌 phs 从低粘附板转移到含有间皮单层的板中。最终，荧光延时视频显微镜用于量化对照癌和实验性卵巢癌的相对能力。SP 在间皮单层中形成一个整体。

与现有的终点测定相比，该技术的主要优点是荧光标记细胞和延时视频显微镜的组合用于监测近中清除率随时间变化的动力学 在卵巢癌 PHE 形成之前，有必要准备低粘附。96 孔圆底培养皿。为了生产这些培养皿，向 96 孔细胞培养皿的每个孔中加入 30 微升 poly hema 溶液。

将 96 孔板在 37 摄氏度的非加湿培养箱中孵育 24 至 48 小时以蒸发乙醇，在每个板上留下一层聚 hema 膜。这种聚乙烯 Hema 薄膜可防止细胞附着在孔底部，迫使细胞在悬浮液中生长。本实验中表达红色荧光蛋白的卵巢癌细胞在 10% 基础培养基中培养，当低粘附培养板准备好时，这是一种定制的细胞培养基。

胰蛋白酶是卵巢癌细胞板，首先用 PBS 洗涤板，然后加入 1 毫升胰蛋白酶并在 37 摄氏度下孵育板 4 分钟 5 分钟。加入 10% 基础培养基淬灭胰蛋白酶后，将细胞悬液转移至 15 mL 锥形聚丙烯管中。在台式离心机中以 900 RCF 沉淀细胞 3 分钟，吸出上清液，并将细胞重悬于 10% 基础培养基中。

使用血细胞计数器计数细胞后，将细胞浓度调整为每 50 微升 10% 基础培养基 100 个细胞 向 96 孔聚乙烯 hema 包被培养皿的每个孔中加入 50 微升均匀悬浮的稀释细胞悬液 将 96 孔板在 37 摄氏度细胞培养箱中孵育 16 小时，以使卵巢癌细胞聚集在一起， 在每个孔中形成单个多细胞类固醇。要开始此过程，请在六孔玻璃底垫技术培养皿的孔中加入纤连蛋白。向培养皿的每个孔中加入 2 毫升纤连蛋白 PBS 溶液，并在 B 室温下孵育 30 分钟。

表达绿色荧光蛋白的间皮细胞，用于形成间皮细胞单层，我们在 10% 碱培养基胰蛋白酶中培养，眼睛是一板间皮细胞，并在台式离心机中以 900 RPM 离心3 分钟。吸出上清液，将细胞重悬于 10% 基础培养基中，用 10% 基础培养基调节至所需浓度。当 mat tech 培养皿的纤连蛋白孵育 30 分钟后，用 2 毫升 PBS 洗涤孔，吸出 PBS 并接种 6 次，每 6 孔 10 至 5 个间皮细胞在 6 孔 mat tech 培养皿的每个孔中。

将 mat tech 培养皿在 37 摄氏度的细胞培养箱中孵育过夜，以使间皮细胞附着在培养皿上并形成单层。要开始此测定，请使用移液器从 96 孔聚乙烯 hema 涂层板中收集卵巢癌 PHE，从含有间皮细胞单层洗涤液的六孔 mat tech 培养皿的一个孔中吸出培养基，用 2 毫升 PBS 洗涤一次，将 96 鲸鱼板中的所有 PHE 添加到 mattec 培养皿的一个孔中。这大约是将要成像的类固醇数量的三倍，以解释 PHE 落在无法成像的培养皿部分。

由于我们只想在每个视野中对一种类固醇进行成像，因此必须避免类固醇的聚集。轻轻地从一侧到另一侧摇动培养皿，使类固醇在附着之前均匀分布在单层细胞上。将 mat tech 培养皿放在倒置宽场荧光显微镜的载物台上。

能够进行至少 8 小时的延时成像。使用电动载物台对培养皿中的多个位置进行成像，并具有多个 OID 内部排序事件。在单个实验中，卵巢癌细胞 PHE 将沉降到培养皿底部并附着在间皮细胞上。

单层每 10 分钟收集 20 次 plus sphe 单层相互作用的 G-F-P-R-F-P 和相位图像，持续 8 小时。在间皮细胞清除试验中，表达 RFP 的卵巢癌细胞 PHE 将侵入表达 GFP 的间皮细胞单层，在单层中形成孔洞。通过使用元件软件或其他合适的软件（如图像 J）跟踪 GFP 图像中的黑洞来测量孔的大小，然后将 8 小时时的孔的大小除以相应 RFP 图像中类固醇的大小，将孔的大小归一化为初始球体大小。 间皮细胞清除测定可用于比较经过基因改造的卵巢癌细胞 SPHE 的侵袭能力，以阐明卵巢癌细胞类固醇清除的分子机制。

在这个例子中的间皮单层，O VCA 4 33 卵巢癌细胞的间皮清除能力。将 Talon 表达减弱的 Phs 与对照 OVCA 4 33 OID 的 Phs 进行比较。测量扩散 PHE 在单层中产生的孔，并平均每组的 6 个位置。

如图所示，Talon one 敲除类固醇产生的平均清除面积明显小于对照类固醇产生的平均面积，这表明 Talon 是 OVCA 4 33 卵巢癌 sps 间皮清除所必需的。这部延时电影显示了对照 OVCA 4 33 红色类固醇侵入绿色间皮单层。下一部延时电影是 OVCA 4 33 红色类固醇，其中 Talon 1 的表达减弱，侵入绿色间皮单层。

与前一部电影相比，很明显，类固醇中 Talon one 表达的衰减降低了间皮清除能力。观看此视频后，您应该对如何使用延时视频显微镜监测卵巢癌、多细胞类固醇和间皮细胞单层细胞随时间推移的相互作用有很好的了解。