Name: 这些模型在体外间皮间隙检测卵巢癌转移的早期步骤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 了解利用荧光标记和延时显微镜技术定量分析卵巢癌细胞侵袭间皮单层的能力。该方法为研究卵巢癌转移机制提供了重要的可视化工具。

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我们感谢哈佛医学院尼康影像中心，特别是Jennifer Waters、Lara Petrak和Wendy Salmon，为我们提供培训以及使用其延时显微镜的机会。我们还要感谢Rosa Ng和Achim Besser提出的宝贵讨论意见。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金5695837（资助M. Iwanicki）和GM064346（资助JSB）以及Dr. Miriam和Sheldon G. Adelson医学研究基金会资助项目的支持。

1. 卵巢癌细胞球体形成
<ol>
 <li>在10%基础培养基（一种含有199与MCDB105培养基以50:50比例混合的定制细胞培养基，添加10%灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素）中培养表达RFP的卵巢癌细胞。若需在未标记的卵巢癌细胞中表达RFP，可通过转染含有RFP的质粒并筛选表达RFP的细胞实现。或者，也可使用病毒载体瞬时表达荧光蛋白，或预先将细胞与红色荧光细胞示踪染料（Invitrogen）共孵育。</li>
 <li>在形成卵巢癌细胞球之前，需准备低吸附96孔圆底培养板。为制备低吸附培养板，向Corning公司生产的96孔细胞培养板的每孔中加入30μl聚羟乙基甲基丙烯酸甲酯（poly-HEMA）溶液（6mg聚羟乙基甲基丙烯酸甲酯溶于1ml 95%乙醇中）。将96孔板置于37°C非湿润培养箱中孵育，使乙醇蒸发，从而在每孔内壁形成一层poly-HEMA薄膜。该poly-HEMA薄膜可防止细胞贴附于孔底，迫使细胞在悬浮状态下生长18。[也可直接使用Ultra-Low Attachment培养板（Corning）替代经poly-HEMA包被的培养板。]</li>
 <li>在完成低吸附培养板的制备后，用胰酶消化一板卵巢癌细胞，在台式离心机（Heraeus）中以900 RCF离心3分钟收集细胞，吸除上清液，并用10%基础培养基重悬细胞。</li>
 <li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
 <li>调整细胞浓度，使每50μl 10%基础培养基中含有100个细胞。</li>
 <li>将均匀悬浮的稀释后细胞悬液50μl加入至96孔poly-HEMA包被培养板的每一孔中。</li>
 <li>将96孔板置于37°C细胞培养箱中孵育16小时（具体时间可根据特定细胞系形成多细胞球所需时间或实验设计需求适当延长或缩短），以使卵巢癌细胞聚集并形成单个多细胞球体。部分肿瘤细胞在此期间可能发生凋亡，因此应选择在细胞凋亡发生前的时间点进行实验。</li>
</ol>
2. 间皮细胞单层形成
<ol>
 <li>在细胞培养超净台中，向 MatTek 品牌的 6 孔玻璃底培养皿的每个孔中加入 2 mL 浓度为 5 μg/mL 的纤连蛋白（fibronectin）PBS 溶液，室温孵育 30 分钟，以完成孔板的包被。MatTek 培养皿的玻璃底具有优良的光学性能，适用于高分辨率显微成像。</li>
 <li>表达 GFP 的间皮细胞在含 10% 基础培养基（Base Medium）的条件下进行培养。将一板间皮细胞用胰蛋白酶消化后，在台式离心机（Heraeus）中以 900 RPM 离心 3 分钟，吸除上清液，并用 10% 基础培养基重悬细胞。本实验所用间皮细胞在获取时已表达 GFP；若使用未标记的间皮细胞，可通过转染含有 GFP cDNA 的质粒，或使用绿色荧光细胞示踪染料（Invitrogen）预孵育细胞来实现标记。</li>
 <li>完成 30 分钟纤连蛋白孵育（步骤 2.1）后，用 2 mL PBS 洗涤 MatTek 培养皿的各孔。</li>
 <li>吸除 PBS，向每个 6 孔 MatTek 培养皿的每孔中接种 6 × 105 个间皮细胞。将 MatTek 培养皿置于 37°C 细胞培养箱中过夜孵育，使间皮细胞充分贴壁并形成单层细胞层。</li>
</ol>
3. 间皮细胞清除实验
<ol>
 <li>使用移液器从96孔聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）包被的培养板中收集卵巢癌类球体。</li>
 <li>吸除含有间皮细胞单层的一孔6孔MatTek培养皿中的培养基，用2 mL PBS洗涤一次。将96孔板中的所有类球体加入MatTek培养皿的一孔中（类球体数量约为拟成像数量的3倍，以补偿落在无法成像区域的类球体）。</li>
 <li>将MatTek培养皿置于倒置宽场荧光显微镜的载物台上，该显微镜需具备至少8小时的延时成像能力。使用电动载物台在同一实验中对培养皿内多个位置进行成像，以捕获多个类球体嵌入事件。我们使用的设备为尼康Ti-E倒置电动宽场荧光延时显微镜，配备集成的Perfect Focus系统、低倍率[20×-0.75数值孔径（NA）]的微分干涉差（DIC）光学系统、尼康卤素透射光源及0.52 NA长工作距离（LWD）聚光镜、尼康快速（切换时间<100毫秒）激发与发射滤光片（GFP激发480/40，发射525/50；RFP-mCherry激发575/50，发射640/50）、Sutter快速透射与落射荧光光路智能快门、尼康线性编码电动载物台、Hamamatsu ORCA-AG冷却电荷耦合器件（CCD）相机、定制的显微镜培养箱（具备温度与CO2控制功能）、尼康NIS-Elements AR软件版本3，以及TMC防振台。</li>
 <li>卵巢癌细胞类球体会沉降至培养皿底部，并附着于间皮细胞单层。在8小时内，每隔10分钟采集20个以上类球体与单层细胞相互作用的GFP、RFP及相差图像。</li>
 <li>表达RFP的卵巢癌细胞类球体会侵入表达GFP的间皮细胞单层，从而在单层中形成空洞。8小时后，使用Elements软件（或其他适用软件如ImageJ）在GFP图像中标记黑色空洞区域，测量空洞大小。通过将8小时时空洞大小除以零时相对应RFP图像中类球体的初始大小，对空洞大小进行归一化处理。本示例中仅测量了一次空洞大小，但可在整个8小时实验过程中多次测量，以更深入地理解嵌入过程的动力学特征。</li>
</ol>
4. 代表性结果
在本示例中，我们比较了talin-1表达减弱的OVCA433卵巢癌细胞球状体与对照组OVCA433球状体在间皮清除能力上的差异。将每组的OVCA433球状体分别加入含有ZT间皮细胞单层的MatTek培养皿中。每组选取六个球状体，每隔10分钟成像一次，持续八小时（图4，视频3，视频4）。通过测量球状体扩散后在单层细胞上形成的空隙面积，并对每组六个位置的测量值取平均。图4显示，talin-1敲低组球状体产生的平均清除面积显著小于对照组球状体所产生的平均面积，表明talin-1是OVCA433卵巢癌细胞球状体实现间皮清除所必需的。
<img alt="卵巢癌细胞侵袭示意图；间皮细胞单层、细胞迁移过程" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 卵巢癌转移过程。原发性卵巢肿瘤起源于卵巢表面上皮或输卵管。肿瘤细胞或细胞簇从原发肿瘤脱落并积聚在腹腔内。这些肿瘤细胞可聚集形成多细胞球状体。球状体随后附着于覆盖腹腔内壁的间皮细胞单层。附着的卵巢癌球状体会导致其下方的间皮细胞被推开，从而使球状体得以接触并侵入下方的基底膜。
视频 1. 卵巢癌转移。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_1_Lower_Quality.mp4">点击此处观看视频</a>。
<img alt="正常腹膜与卵巢癌转移组织学对比示意图；箭头标示间皮细胞。" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 间皮细胞排列于人腹膜组织表面，并被排除在卵巢癌细胞种植灶下方区域之外。
<img alt="卵巢癌细胞球体与间皮细胞单层相互作用的实验示意图。" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 间皮清除实验。通过将每孔100个表达RFP的卵巢癌细胞接种于经聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）包被的96孔圆底培养板中，在37°C下孵育16小时，以形成卵巢癌细胞球体。poly-HEMA可防止细胞贴附于培养板表面，从而使细胞保持悬浮状态并相互黏附，每孔形成单一细胞簇。间皮细胞单层的制备方法为：将每孔6×105个间皮细胞接种于经纤连蛋白包被的6孔MatTek培养皿中，并在37°C下孵育16小时。随后将细胞球体转移至含有间皮细胞单层的MatTek培养皿中，利用Nikon Ti-E倒置电动宽场荧光延时显微镜及Elements软件，每隔10分钟对两种细胞群体进行一次成像，持续8小时。
视频 2. 间皮细胞清除实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_2_lower_quality.mp4">点击此处观看视频</a>。
<img alt="间皮细胞清除能力分析；卵巢癌球状体与间皮细胞；箱形图结果。" src="/files/ftp_upload/3888/3888fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. OVCA433 球状体中踝蛋白 1（talin 1）表达减弱会降低其对间皮细胞的清除能力。将表达正常或减弱的 OVCA433 球状体（红色）接种至 ZT 间皮细胞单层（绿色）上，使其附着并侵入。使用尼康 Ti-E 倒置电动宽场荧光延时显微镜及 Elements 软件，每 10 分钟对两种细胞群体进行一次成像，持续 8 小时。结果图显示，踝蛋白 1 表达减弱显著降低了间皮细胞的清除能力（均值以绿色条形表示的分位数图）。
视频 3. 对照 OVCA433 类球体（红色）侵袭间皮单层细胞（绿色）的过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_3.mov">点击此处观看视频</a>。
视频 4. OVCA433 类球体（红色）中talin 1表达的减弱会降低间皮细胞（绿色）的清除能力。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_4.mov">点击此处观看视频</a>。

<ol><li>Jemal, A. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).</li>
<li>Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRies%2C+LG+%22SEER+Cancer+Statistics+Review%2C+1975-2005%22">SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005</a>. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005">http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005</a> (2007).</li>
<li>Burleson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).</li>
<li>Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electron+Microscopic+Study+of+the+Invasion+of+Ascites+Tumor+Cells+into+the+Abdominal+Wall%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall.</a> Cancer Res. 25, 490-497 (1965).</li>
<li>Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+explants+of+peritoneum+and+endometrium%3A+a+novel+model+of+the+early+endometriosis+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion.</a> Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).</li>
<li>Zhang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+growth+patterns+of+human+peritoneal+mesothelial+cells%3A+comparison+between+advanced+epithelial+ovarian+cancer+and+non-ovarian+cancer+sources%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Soc.+Gynecol.+Investig%22%5BJournal%5D)">Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources.</a> J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).</li>
<li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Line+of+Intra-abdominal+Metastatic+Attack%3A+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).</li>
<li>Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+human+ovarian+tumor+cells+with+human+mesothelial+cells+grown+on+extracellular+matrix.+An+in+vitro+model+system+for+studying+tumor+cell+adhesion+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion.</a> Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).</li>
<li>Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+novel+3D+culture+model+to+elucidate+the+role+of+mesothelial+cells%2C+fibroblasts+and+extra-cellular+matrices+on+adhesion+and+invasion+of+ovarian+cancer+cells+to+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum.</a> Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).</li>
<li>Ksiazek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+peritoneal+mesothelial+cells+promote+ovarian+cancer+cell+adhesion%3A+the+role+of+oxidative+stress-induced+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin.</a> Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).</li>
<li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disaggregation+and+invasion+of+ovarian+carcinoma+ascites+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids.</a> J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).</li>
<li>Heyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitronectin+and+its+receptors+partly+mediate+adhesion+of+ovarian+cancer+cells+to+peritoneal+mesothelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour.+Biol%22%5BJournal%5D)">Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro.</a> Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).</li>
<li>Heyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+vitronectin+stimulates+migration+of+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells.</a> Cell. Biol. Int. 34, 493-502 Forthcoming.</li>
<li>Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+and+beta1+integrin+mediate+ovarian+carcinoma+cell+adhesion+to+peritoneal+mesothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells.</a> Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).</li>
<li>Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+human+ovarian+adenocarcinoma+IGROV1+cells+to+endothelial+cells+is+partly+mediated+by+the+alphav+integrins-vitronectin+adhesive+system+and+induces+an+alteration+of+endothelial+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity.</a> Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).</li>
<li>Leroy-Dudal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmigration+of+human+ovarian+adenocarcinoma+cells+through+endothelial+extracellular+matrix+involves+alphav+integrins+and+the+participation+of+MMP2%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2.</a> Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).</li>
<li>Iwanicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).</li>
<li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cell+shape+in+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li>
<li>Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells%3A+a+potential+model+for+ovarian+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).</li>
<li>Roberts, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+molecular+and+cellular+events+during+neoplastic+progression%3A+a+mouse+syngeneic+ovarian+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model.</a> Neoplasia. 7, 944-956 (2005).</li>
<li>Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+assay+system+for+transendothelial+tumor+cell+invasion%3A+significance+of+E-selectin+and+alpha+3+integrin+in+the+transendothelial+invasion+by+HT1080+fibrosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells.</a> Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+studying+heterotypic+cell-cell+interactions+and+tissue+specimen+cultures+under+controlled+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments.</a> Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).</li>
<li>Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-extravasation+model+--+selection+of+highly+motile+and+metastatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">3D-extravasation model -- selection of highly motile and metastatic cancer cells.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).</li>
<li>Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+I+contributes+to+the+generation+of+resting+cortical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension.</a> Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).</li>
<li>Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transendothelial+migration+of+colon+carcinoma+cells+requires+expression+of+E-selectin+by+endothelial+cells+and+activation+of+stress-activated+protein+kinase-2+%28SAPK2%2Fp38%29+in+the+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).</li>
<li>Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+and+micromechanics+of+tumor+cell+chemotactic+protrusion%2C+locomotion%2C+and+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation.</a> Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

本文介绍的“间皮清除实验”利用延时显微技术，以高时空分辨率监测卵巢癌多细胞球体与间皮细胞单层之间的相互作用。此前，多个研究团队8-14已采用终点法实验表明，卵巢癌细胞能够附着并侵入间皮细胞单层。本实验的独特之处在于使用荧光标记的细胞，以区分肿瘤细胞与间皮细胞，从而在整个实验过程中动态观察这两类细胞群体的行为。细胞嵌入过程可被实时可视化，间皮清除速率也可随时间进行定量测量。延时显微技术的应用使得研究者能够在不同实验条件下密切监测两类细胞群体间相互作用的动力学特征。此外，可对少量间皮细胞或卵巢癌细胞用第三种荧光标记物进行标记，以追踪细胞群体中单个细胞的动态行为。通过随时间追踪单个细胞，可计算其迁移的方向性和速率。为了对间皮清除过程进行更高分辨率的分析，可采用全内反射荧光（TIRF）显微技术。若在间皮细胞中标记了黏着斑结构，则可如我们先前发表的研究17所述，监测肿瘤细胞的突起结构对间皮细胞黏着斑的解离过程。
该实验可用于比较经过基因修饰或药物处理的卵巢癌细胞球状体的侵袭能力，以阐明卵巢癌细胞球状体清除间皮单层的分子机制，或用于鉴定该过程的小分子...

<table><tbody><tr><td>OVCA433 卵巢癌细胞</td><td></td><td></td><td>由 Dennis Slamon 博士惠赠</td></tr><tr><td>ZT 间皮细胞</td><td></td><td></td><td>由 Tan Ince 博士惠赠</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>GIBCO，Life Technologies 公司</td><td>19950</td><td></td></tr><tr><td>MCDB105</td><td>Cell Applications 公司</td><td>117-500</td><td></td></tr><tr><td>灭活胎牛血清（FBS-heat inactivated）</td><td>GIBCO，Life Technologies 公司</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep）</td><td>GIBCO，Life Technologies 公司</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Corning 公司</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>聚羟乙基甲基丙烯酸酯（polyhydroxyethylmethacrylate, poly-HEMA）</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>192066-25G</td><td>配制 poly-HEMA 溶液：将 6 mg poly-HEMA 粉末溶于 1 ml 95% EtOH 中</td></tr><tr><td>乙醇（EtOH）</td><td>Pharmco-AAPER 公司</td><td>111ACS200</td><td>用 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 稀释至 95%</td></tr><tr><td>细胞培养超净台</td><td>Nuaire 公司</td><td>NU-425-300</td><td></td></tr><tr><td>组织培养孵箱</td><td>Thermo Fisher Scientific 公司</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>poly-HEMA 板专用孵箱</td><td>Labline Instruments 公司</td><td>Imperial III 305</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Heraeus Instruments 公司</td><td>75003429/01</td><td></td></tr><tr><td>6 孔玻璃底培养皿</td><td>MatTek 公司</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白（Fibronectin）</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>F1141-1MG</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Cellgro 公司</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments 公司</td><td></td><td>Ti-E 倒置电动荧光延时显微镜，配备集成的 Perfect Focus 系统</td></tr><tr><td>物镜</td><td>Nikon Instruments 公司</td><td></td><td>20X-0.75 数值孔径</td></tr><tr><td>卤素透射光源</td><td>Nikon Instruments 公司</td><td></td><td>0.52 NA 长工作距离聚光镜</td></tr><tr><td>激发与发射滤光片</td><td>Chroma Technology 公司</td><td></td><td>GFP 激发 480/40，发射 525/50；RFP-mCherry 激发 575/50，发射 640/50</td></tr><tr><td>透射光与落射荧光光路</td><td>Sutter Instrument 公司</td><td></td><td>智能快门（Smart Shutters）</td></tr><tr><td>线性编码电动载物台</td><td>Nikon Instruments 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>制冷型电荷耦合器件相机</td><td>Hamamatsu 公司</td><td>ORCA-AG</td><td></td></tr><tr><td>配备温度与 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 控制的显微镜培养室</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>防振台</td><td>TMC 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements 软件</td><td>Nikon Instruments 公司</td><td></td><td>版本 3</td></tr></tbody></table>

体外 腹膜间皮清除实验：模拟卵巢癌转移早期步骤

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

卵巢癌是美国癌症相关死亡的第五大原因1。尽管患者对初始治疗反应良好，但70%至90%的卵巢癌女性患者会发展出新的转移灶，且复发常导致死亡2。因此，为了更好地治疗中晚期卵巢癌，有必要深入了解继发性转移灶的形成机制。卵巢癌的转移发生在恶性细胞从原发肿瘤部位脱落并扩散至腹腔的过程中。这些播散的细胞可形成多细胞簇，即球状体，它们可能保持游离状态，或种植于腹腔内的器官表面3（图1，视频1）。
腹膜腔内的所有器官均由单层连续的间皮细胞所覆盖4-6（图2）。然而，电子显微镜对切除的人类肿瘤组织切片的研究显示，在腹膜肿瘤团块下方不存在间皮细胞3,5-7（图2）。这表明间皮细胞被某种未知机制排除在肿瘤团块下方之外。
上一步 体外 实验表明，原发性卵巢癌细胞对细胞外基质的黏附效率高于对间皮细胞的黏附8，而最近的研究表明，原发性腹膜间皮细胞实际上对卵巢癌细胞的黏附和侵袭具有屏障作用（相较于未被间皮细胞覆盖的基质上的黏附和侵袭）9,10这表明间皮细胞可作为抵御卵巢癌转移的屏障。然而，直到最近，卵巢癌细胞突破该屏障并排斥间皮细胞的细胞与分子机制仍不明确。 
在此我们描述了一种方法 体外 模拟卵巢癌细胞球体与间皮细胞相互作用的检测方法 在体 （图3，视频2）。我们的实验方案改编自先前报道的用于分析卵巢肿瘤细胞与间皮单层细胞相互作用的方法。8-16，并首次在一份报告中被描述，该报告指出卵巢肿瘤细胞利用整合素依赖性的肌球蛋白激活和牵引力，促进从肿瘤球体下方排除间皮细胞17该模型利用延时荧光显微镜实时监测两个细胞群体，提供细胞相互作用的空间和时间信息。卵巢癌细胞表达红色荧光蛋白（RFP），而间皮细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）。表达RFP的卵巢癌细胞球体附着于表达GFP的间皮细胞单层上，随后球体铺展、侵袭，并将间皮细胞推开，在单层中形成一个空洞。该空洞在GFP图像中表现为负空间（黑色）。通过测量空洞面积，可对对照组与实验组卵巢癌细胞和/或间皮细胞之间的清除活性差异进行定量分析。该检测仅需少量卵巢癌细胞（每球体100个细胞 × 每条件20–30个球体），因此适用于珍贵的原代肿瘤细胞样本。此外，该检测易于扩展用于高通量筛选。

本文所述的间皮清除实验利用荧光标记的细胞和延时视频显微镜技术，对卵巢癌多细胞球状体与间皮细胞单层之间的相互作用进行可视化观察和定量测量。该实验模拟了卵巢癌转移的早期步骤。

卵巢癌是美国癌症相关死亡的第五大主要原因1。尽管患者对治疗的初始反应良好，70%至90%……

本实验的总体目标是评估卵巢癌多细胞类固醇侵袭间皮单层的能力。首先将表达红色荧光蛋白的卵巢癌细胞在低黏附培养板中孵育，以形成多细胞类固醇；接下来，将表达绿色荧光蛋白的间皮细胞接种于纤维连接蛋白包被的玻底培养皿中，形成单层细胞。最后一步是将卵巢癌细胞球体从低黏附培养板转移至含有间皮单层的培养板中。最终利用荧光延时视频显微镜来定量评估对照组和实验组卵巢癌细胞球体在间皮单层上形成空隙的相对能力。该技术相较于现有终点检测方法的主要优势在于，结合使用荧光标记细胞与延时视频显微镜，以实时监测中线清除过程的动态变化。在制备卵巢癌 phe 之前，需先准备低黏附性的 96 孔圆底培养板。为制备此类培养板，向 96 孔细胞培养板的每孔中加入 30 µL 的聚羟基乙酸（poly hema）溶液。将96孔板置于37摄氏度非湿润培养箱中孵育24至48小时，以蒸发乙醇，使每个孔中留下一层聚HEMA薄膜。该聚HEMA薄膜可防止细胞贴附于孔底，迫使细胞在悬浮状态下生长。本实验中表达红色荧光蛋白的卵巢癌细胞在低黏附培养板准备就绪后，使用10%基础培养基（一种定制的细胞培养基）进行培养。用PBS洗涤卵巢癌细胞培养板后，加入1毫升胰蛋白酶，并在37摄氏度孵育4至5分钟，以消化细胞。加入含10%基础培养基的完全培养基以终止胰蛋白酶消化作用，随后将细胞悬液转移至15毫升圆锥形聚丙烯离心管中。在台式离心机中以900 ×g离心3分钟使细胞沉淀，吸除上清液，并将细胞重悬于含10%基础培养基的完全培养基中。使用血细胞计数板计数细胞后，将细胞浓度调整为每50微升10%基础培养基中含有100个细胞。取50微升均匀悬浮的稀释细胞悬液加入96孔聚HEMA包被培养板的每个孔中。将96孔板置于37摄氏度的细胞培养箱中孵育16小时，使卵巢癌细胞聚集在一起，在每个孔中形成单一的多细胞球体。开始此操作前，预先用纤连蛋白包被六孔玻璃底MatTek培养皿的各孔。向培养皿的每个孔中加入2毫升纤连蛋白PBS溶液，并在室温下孵育30分钟。将表达绿色荧光蛋白的间皮细胞用于形成间皮细胞单层，我们在10%基础培养基中培养，并用胰蛋白酶消化。取一板间皮细胞，在台式离心机中以900 RPM离心3分钟。吸除上清液，并用10%基础培养基重悬细胞，再用10%基础培养基调整至所需浓度。当Matrigel培养皿的纤维连接蛋白孵育30分钟结束后，用2毫升PBS洗涤各孔，吸除PBS，然后在每个六孔Matrigel培养皿的每孔中接种6×10⁵个间皮细胞。将MatTek培养皿置于37摄氏度的细胞培养箱中孵育过夜，以使间皮细胞贴壁并形成单层。开始该实验时，使用移液器从96孔聚HEMA包被板中收集卵巢癌PHE，从含有间皮细胞单层的6孔MatTek培养皿的一个孔中吸除培养基，用2毫升PBS洗涤一次，然后将96孔板中的全部PHE加入MatTek培养皿的一个孔中。所加细胞数

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体外腹膜间皮清除实验：模拟卵巢癌转移早期步骤

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