脓毒症动物模型，用于评估新型草药疗法

败血症是指从微生物感染导致的全身炎症反应综合征，可以被称为盲肠结扎穿刺（CLP）外科技术模拟。在这里，我们描述了一个方法来使用CLP诱导的动物模型，筛选治疗药物的药材。

该程序的总体目标是通过称为 SQL 结扎和穿刺或 CLP 的外科手术产生脓毒症小鼠模型。这是通过首先在小鼠的腹部做一个 1.5 到 2 厘米的中线切口来实现的。接下来，暴露并结扎 seum，然后穿刺 seum 以诱导细菌易位。

最后，闭合切口。最终，可以获得显示全身和腹膜细胞因子水平增加以及嗜睡和致死等症状的结果。我将向您展示的是制作一个名为 sation and puncture 的小鼠脓毒症模型，该模型是从 Chandry 博士和他的合作者开发的原始模型修改而来的。

该模型的平均主要优点是它是与脓毒症最相关的模型。此外，它简单、表征良好且经济上可行，因此已广泛应用于脓毒症和炎症研究领域。例如，我们将演示该模型的利用来评估草药提取物在脓毒症中的治疗潜力。

要制备草药提取物，请将 10 克草药浸泡在 200 毫升水中，在 85 摄氏度下浸泡 1 至 4 小时以去除不溶性颗粒，将水馏分以 3， 300 克离心，在 4 摄氏度下离心 20 分钟。接下来，通过 0.2 微米过滤器过滤上清液。然后，使用截留分子量为 10， 000 千道尔顿的离心过滤器，在 4 摄氏度下以 5， 000 G 旋转 60 分钟，进一步浓缩滤液。

使用巨噬细胞培养物筛选低分子量和高分子量分数对抑制晚期促炎介质的活性，例如高迁移率组 box 1 或 HGB 1。首先开始巨噬细胞分离，腹膜间向正常小鼠中注入 2 毫升 4%TH 乙二醇肉汤，收获原代腹膜巨噬细胞培养物三天后，DMEM 中的巨噬细胞补充有 10% FBS、2 毫摩尔谷氨酰胺和 1% 青霉素。链霉素用 optimum 轻轻洗涤贴壁巨噬细胞，并将它们在同一培养基中孵育 2 小时。

然后在刺激后 16 小时用细菌内毒素脂多糖或 LPS 刺激它们。收集细胞条件培养基并使用它来进行蛋白质印迹。测量 HM GB 的水平。

使用纯化的 H mgb one 生成的标准曲线量化条带强度，以在肌肉注射每公斤氯胺酮 75 毫克和每公斤甲苯噻嗪 20 毫克麻醉小鼠后建立败血症。并使用脚趾捏来检查其镇静水平。将鼠标置于仰卧位，清洁腹部，然后做一个 15 毫米的中线切口，用 4 oh 丝缝合线从续尖端露出距后尖端约 5 毫米的盲肠。

结扎盲肠，然后用 22 号针刺穿结扎的后遗症残端一次，让粪便挤出，立即将盲肠恢复到正常的腹腔内位置并闭合腹部。动物恢复意识和活动能力后。24 小时后将笼子放回动物房。

CLP 后腹膜内每天给予 200 微升草药提取物或对照，持续三天。在 seq l 结扎和穿刺或 CLP 手术后的几个小时内，只要需要，就可以监测动物的存活率。动物表现出脓毒症的临床症状，包括脱毛、嗜睡、蜷缩以及食物和水摄入量减少。

发生严重腹膜炎并伴有连续全身感染的动物通常在 48 至 96 小时内死亡。然而，即使是年龄、性别和遗传背景匹配的动物也可以在实验性败血症过程中以可区分的方式对手术做出反应，例如，在 CLP 后 48 小时。虽然一些动物可能已经接近了此处定义的土丘状态，但其他动物可能仍处于非垂死状态。

对循环细胞因子的全面调查显示，几种细胞因子的水平存在巨大差异，包括 IL 6、kc、MIP 2 和 ST nfr，其中一种在垂死状态和非垂死状态的小鼠之间。值得注意的是，这些炎症介质已被归类为脓毒症的替代标志物，因为它们的循环水平是实验性或临床脓毒症致死结果的可靠预测指标。此外，CLP 诱导各种促炎和抗炎细胞因子和趋化因子的局部释放，例如，在 CLP 后 48 小时，大量的细胞因子 IL six 和趋化因子 KC 和 MI P 2 不仅可以在血液中全身测量，而且可以在腹膜灌洗液中局部测量。

在这里，评估了各种草药提取物或对照化合物抑制内毒素诱导的 HGB one 释放的能力。那些具有抑制 HGB one 释放能力的小鼠使用败血症小鼠模型在体内进一步测试。由于 HGB one 在实验性脓毒症中积累的晚期和长期动力学，第一剂 HGB one 抑制剂在脓毒症发作后 24 小时给药，此时小鼠出现明显的脓毒症迹象，包括嗜睡、腹泻和竖毛，如图所示，延迟和重复施用主要的绿色 T 成分 epi Gallo， 儿茶素三没食子酸酯或 EGCG 在败血症发作后 24 小时开始，即使口服 EGCG 也能显着拯救小鼠免受致命败血症，将动物存活率从 16% 显着提高到 44%一旦掌握了这种结扎，穿刺模型可以在不到五分钟的时间内完成，如果作得当。