Name: 急性片的成年小鼠前脑的神经细胞迁移的延时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 了解成年小鼠前脑神经母细胞迁移的延时成像方法。该技术利用宽场荧光显微镜在急性脑片中实时捕捉神经元前体细胞的动态迁移过程，为研究神经发育中的细胞迁移机制提供重要见解。

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本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）向 A.S. 提供的资助。J.K. 获得了拉瓦尔大学博士后奖学金的部分支持。A.S. 获得了加拿大产后神经发生领域研究讲席职位。

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<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
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<li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li>
<li>Bovetti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+scaffold+for+neuroblast+migration+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Nam, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+subventricular+zone+stem+and+progenitor+cells+are+sessile+and+epidermal+growth+factor+receptor+negatively+regulates+neuroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration.</a> PLoS One. 4, e8122(2009).</li>
<li>Bortone, D., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCC2+expression+promotes+the+termination+of+cortical+interneuron+migration+in+a+voltage-sensitive+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner.</a> Neuron. 62, 53-71 (2009).</li>
<li>Comte, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

神经前体细胞正确迁移到相应脑区是神经环路正常组装和功能实现的基本过程。绝大多数细胞仅在胚胎发育期间发生迁移，而在出生后的脑组织中，只有少数区域（如嗅球、齿状回和小脑）仍存在神经元的迁移活动。然而，调控出生后脑内细胞迁移的机制目前仍不清楚。深入了解成熟神经系统中引导细胞迁移的相关机制和分子通路，将有助于我们更好地理解出生后脑内神经元的靶向定位，并可能为开发诱导神经元募集至脑部病变区域的新策略提供临床意义。
在本文中，我们描述了一种用于监测成年小鼠前脑急性脑片中细胞迁移的实验方案。尽管我们以成年小鼠的SVZ-OB通路作为模型系统，但该技术同样可用于追踪胚胎期及出生后早期脑组织中的细胞迁移，以及成年脑损伤后的细胞迁移过程。我们已利用该方案成功追踪了出生后早期喙侧迁移流（RMS）12、小脑以及成年卒中后纹状体中的细胞迁移（Eiriz, Grade, Malva 和 Saghatelyan，未发表数据）。
使用急性活体脑片进行神经母细胞迁移成像，该方法可在高度模拟体内微环境的条件下研究细胞迁移 体内</em...

<table><tbody><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖（ACSF）</td><td>EMD</td><td>DX0145-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCI</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCI&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;x6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;xH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>EMD</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCI&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;x2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>德克萨斯红葡聚糖</td><td>Invitrogen</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>Dextran CascadeBlue</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖（40倍溶液）</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D-5025</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>EMD</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮/赛拉嗪</td><td>CDMV</td><td>5230</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Sarstedt</td><td>62.553.205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管（立体定位注射）</td><td>WPI</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>石蜡油</td><td>EMD</td><td>PX0045-3</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Rougier</td><td>65655-1370</td><td></td></tr><tr><td>缝合</td><td>斯托尔廷</td><td>50487</td><td></td></tr><tr><td>Anafen</td><td>CDMV</td><td>11508</td><td></td></tr><tr><td>20 cc 注射器</td><td>VWR</td><td>SS-20L2</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-094</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>马特实验室</td><td>AP-0108</td><td></td></tr><tr><td>胶水</td><td>Permabond</td><td>910</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Linde</td><td>24068835</td><td></td></tr><tr><td>刀片</td><td>WPI</td><td>501901</td><td></td></tr><tr><td>尼龙网</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5702 000.019</td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>纳升级注射器</td><td>WPI</td><td>B203MC4</td><td></td></tr><tr><td>立体定位注射装置</td><td>WPI</td><td>502900</td><td></td></tr><tr><td>微型钻孔系统</td><td>WPI</td><td>501819</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>920110</td><td></td></tr><tr><td>宽场荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX61WIF</td><td></td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>光度测量</td><td>CS-HQ2-D</td><td></td></tr><tr><td>超静音成像室</td><td>哈佛仪器公司</td><td>64-1487</td><td></td></tr><tr><td>PH-1 Series 20 加热平台</td><td>哈佛仪器公司</td><td>64-0284</td><td></td></tr><tr><td>加热系统</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>40倍水浸物镜</td><td>奥林巴斯</td><td>1-UM587</td><td></td></tr><tr><td>10倍水浸物镜</td><td>Olympus</td><td>1-UM583</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4</td><td>Sutter Instruments</td><td>DG-4/OF</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph 软件</td><td>Molecular Devices</td><td>40000</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Bitplane</td><td>BPI-IM70-F1</td><td></td></tr></tbody></table>

成年小鼠前脑急性脑片中神经母细胞迁移的延时成像

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

大量证据表明，成年哺乳动物大脑的特定区域存在内源性神经干细胞池，能够持续生成新的功能性神经元。源自脑室下区（SVZ）的新生神经母细胞沿吻侧迁移流（RMS）迁移到嗅球（OB）的最终位置1。在RMS中，神经母细胞以链状结构进行切向迁移，这些链状结构被星形胶质细胞突起包绕2,3，并以血管作为结构支撑以及迁移所需分子因子的来源4,5。到达OB后，神经母细胞脱离链状结构，转为径向迁移，进入嗅球的不同层次，在那里分化为中间神经元并整合到已有的神经网络中1,6。
本文中，我们描述了在啮齿类动物脑组织急性切片中监测细胞迁移的实验方法。利用急性切片可评估细胞在高度接近体内真实微环境条件下的迁移行为。 体内 条件以及难以触及的脑区中 体内 成像。此外，该方法避免了类器官和细胞培养所需的长期培养条件，而这些条件最终可能改变细胞的迁移特性。在急性脑片中，可使用微分干涉差（DIC）光学或荧光蛋白对神经前体细胞进行可视化。通过病毒标记侧脑室下区（SVZ）中的神经前体细胞、将报告基因小鼠的成神经细胞移植到野生型小鼠的SVZ中，或使用在成神经细胞中表达荧光蛋白的转基因小鼠，均为可视化成神经细胞并追踪其迁移的有效方法。然而，后一种方法由于标记细胞密度较高，难以对单个细胞进行长时间追踪。我们采用配备CCD相机的宽场荧光直立显微镜，以实现相对较快的图像采集间隔（每15或30秒采集一幅图像），从而可靠地识别静止期和迁移期。准确判定静止期与迁移期的持续时间，对于结果的明确解读至关重要。我们还进行了多步z轴采集，以在三维空间中监测成神经细胞的迁移。宽场荧光成像已被广泛用于可视化神经元迁移过程7-10在此，我们详细描述了标记神经母细胞、对成年小鼠前脑急性脑片中的神经母细胞迁移进行实时视频成像以及分析细胞迁移的方法。尽管本方案以成年小鼠喙侧迁移流（RMS）中神经母细胞的迁移为例进行说明，但该方法同样适用于胚胎期及出生后早期脑组织中细胞迁移的观察。

我们描述了一种在小鼠前脑中进行神经元迁移实时视频成像的实验方案。通过在急性活体脑片中利用宽场荧光成像技术，并以相对较短的时间间隔快速采集图像，记录经病毒标记或移植的神经前体细胞的迁移过程，以研究细胞迁移的不同阶段，包括静止期和迁移期的持续时间以及迁移速度。

大量证据表明，新的功能性神经元是由内源性神经干细胞库持续生成的……

本实验的总体目标是在成年小鼠脑组织的急性切片中研究神经母细胞的迁移。该目标通过以下步骤实现：首先标记成年小鼠脑室下区的神经前体细胞，在神经母细胞标记后的第5至第8天，制备小鼠脑组织的急性切片。随后，对神经母细胞的迁移过程进行延时成像观察。最终，通过宽场实时显微镜技术可展示急性脑片中神经母细胞迁移的动态过程。该方法有助于通过研究不同分子信号及涉及细胞迁移的细胞机制，回答神经发育领域中的关键问题。该技术不仅能够揭示成年脑内调控神经迁移的生理过程，还可应用于其他系统，例如研究缺血性脑组织中的神经迁移以及胚胎发育过程中的神经迁移。开始此操作前，先配制用于切片的蔗糖型人工脑脊液，以及用于成像前维持切片的32摄氏度氯化钠型人工脑脊液（A CSF），然后通过持续向溶液中通入95%氧气和5%二氧化碳混合气体进行氧合。接着，使用荧光标记的前体神经元，通过腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。随后，使用液氮快速制备呈凝胶状的冰冻切割溶液。随后，用20毫升注射器吸取15至20毫升冰冻切割液，对小鼠进行心脏内灌注。如果需要标记血管而非灌注切割液，则将200微升浓度为10毫克/毫升的德克萨斯红葡聚糖经心脏注入左心室，灌注后等待2至3分钟，迅速将小鼠断头，立即将头部浸入冰冻切割液中，并转移至振动切片机。用剪刀沿矢状缝从小脑向嗅球方向剪开颅骨。随后，使用镊子轻轻移除颅骨瓣。接着，用手术刀切除脑部的脑干部分。然后在每个半球最外侧部分进行两次矢状切口，并沿半球间裂隙切割脑组织。之后用刮勺轻轻取出脑组织，放入冰上预冷的切割液中。将两个半球分别放置在4%琼脂块上，背侧接触琼脂。接着，将琼脂块连同两个半球的侧面切割面用胶固定到Vibram的平台上，使内侧朝上。然后，将平台放入Vibram腔室中。用切割液填充。然后在整个切片制备过程中，通过持续向溶液中通入95%氧气和5%二氧化碳的混合气体，以保持溶液的氧合状态。现在使用振动切片机制备厚度为250微米的切片。应使用较低的切片速度和较高的刀片振动频率，以获得高质量的切片。一旦切片从刀片上释放，应立即将其从切削液中轻轻取出，并放入充满充氧人工脑脊液（A-CSF）的孵育 chamber 中，置于水浴中保持 32 摄氏度。在此步骤中，需小心地将切片放置于显微镜的成像 chamber 内，以避免成像过程中切片发生漂移。通过小心地将尼龙网置于其上来固定组织切片。确保切片持续用人工脑脊液（A CSF）灌注。接下来，使用 10 x 物镜找到感兴趣的视野。打开 MetaMorph 软件，确认尼龙网未遮挡成像视野。然后启用 40 倍物镜并调节焦距。确保物镜与切片之间有足够的溶液。使用 Metamorph 软件设置延时成像采集参数，例如激发时间、Z 平面数量、各 Z 截面之间的距离、时间间隔以及记录持续时间。然后开始延时采集。Metamorph 会自动将数据保存为 TIFF 文件，每个文件对应所采集的延时视频中的一个时间点，以便在 Mrs 中打开该视频。通过将视频的第一个时间点图像直接拖放到程序图标上，即可加载已获取的图像。视频加载后，在显示调节窗口中调整信号的亮度和对比度。在图像属性中设置所获取视频的参数，例如体素大小和时间间隔，并设置等间距的时间点窗口。设定体素大小后，即可在三维视图中观察图像帧，以及视频的时间和尺度，从而自动追踪记录的细胞。在Surpass窗口中选择“Spots”功能，在Slice窗口中测量待追踪细胞的直径，为每个视野中的细胞创建一个斑点。设置追踪参数后继续操作。随时间检查检测到的对象的可靠性。如果并非所有迁移细胞都被自动检测到，请调整检测阈值，并确保在所有时间点上所有细胞均已被斑点标记选中。必须设定代表同一轨迹相邻时间点的两个斑点之间的最大距离和最大间隙大小，以便程序能够连接这些时间点。生成轨迹后，可通过直接删除无关轨迹来筛选并去除它们。通过连接或断开不同轨迹以及同一轨迹在不同时间点的部分，可对轨迹进行校正。所有校正完成后，仔细检查轨迹的最终结果，并将数据导出至 Excel 文件，包括每个时间点的细胞位移、轨迹长度、位移距离以及轨迹持续时间等信息。本视频展示了绿色神经母细胞沿葡聚糖、德克萨斯红标记的血管迁移的时间推移成像。请注意，当迁移阶段被静止期打断时，迁移中的神经母细胞表现出跳跃式运动行为。本视频还展示了使用 Imas 软件对神经母细胞迁移进行的轨迹追踪。球体和线条分别表示单个细胞的胞体和迁移轨迹。进行该操作时，需注意应获取高质量的成年小鼠前脑急性活体脑片。此外，应通过小心放置尼龙网，将脑片稳定固定在成像 chamber 中，以避免成像过程中脑片发生漂移。脑脊液灌注速率的任何变化、灌注不规律或温度的剧烈波动，均可能导致成像过程中焦平面漂移和变化。观看本视频后，您应能够充分理解如何在急性成年脑片中记录和分析神经母细胞的迁移过程。我们建议采用较短的成像时间间隔（15至30秒），以可靠地识别迁移相和静止相的起始与终止。

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科研

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Neuroscience

神经科学

急性片的成年小鼠前脑的神经细胞迁移的延时成像

本方案描述了一种针对出生后大脑优化的器官型脑片实验方法，可用于对嗅束迁移流中神经母细胞迁移进行高分辨率的时间推移成像。...

一种用于出生后大脑神经元迁移高分辨率延时成像的器官型脑片实验方法

来源： Wiegreffe, C., 等  利用胚胎小鼠脑组织切片培养进行迁移神经元的延时共聚焦成像 子宫内 电穿孔 J. Vis. Exp. (2017)...

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神经母细胞迁移是出生后神经发生过程中的基本事件。我们描述了一种通过高效标记神经母细胞的方案 体内...

体内 新生期电穿孔与小鼠急性脑切片中神经母细胞迁移的实时成像

本方案提供了直接观察径向迁移皮层神经元的操作指南。In utero...

In Utero 电穿孔法结合脑片培养对小鼠胚胎脑中迁移神经元进行延时共聚焦成像

本文提供了一种低成本且可靠的方法，可从小鼠胚胎制备适用于共聚焦显微镜和活体成像技术的电穿孔脑组织切片培养物。...

Ex Utero 电穿孔及胚胎小鼠脑组织切片培养用于迁移性GABA能中间神经元的活体成像

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

磁共振成像（MRI）已成为研究基因改造小鼠表型的日益流行的工具。本文阐述了利用多只小鼠同时进行MRI扫描，以实现对基因改造小鼠高通量表型分析所必需的方法。...

多只小鼠神经解剖磁共振成像

本视频展示了一种方法，该方法结合了电穿孔技术和共聚焦显微镜技术，用于对发育中的斑马鱼前脑中的单个神经前体细胞进行活体成像。体内水平上对前脑神经前体细胞在克隆水平的发育过程分析可通过此方法实现。...

延时活体成像观察发育中斑马鱼前脑内克隆相关神经前体细胞

本文描述了一种将钙离子指示剂染料加载至脑室下区（SVZ）细胞以记录钙活性的方法。出生后的脑室下区包含紧密排列的细胞，如神经前体细胞和成神经细胞。与浴式加载不同，我们通过压力将染料直接注入组织内部，从而实现更佳的染料扩散效果。...

制备用于钙成像的急性侧脑室下区脑片

本文描述了从分离的海马体制备急性脑切片的方法，以及在刺激Schaffer侧支的同时，对辐射层中的星形胶质细胞和神经元进行同步电生理记录的技术。同时演示了药理学分离星形胶质细胞钾离子和谷氨酸转运体电流的方法。...

急性海马脑片中突触激活的星形胶质细胞与神经元反应的双通道电生理记录

了解成年小鼠前脑神经母细胞迁移的延时成像方法。该技术利用宽场荧光显微镜在急性脑片中实时捕捉神经元前体细胞的动态迁移过程，为研究神经发育中的细胞迁移机制提供重要见解。

成年小鼠前脑急性脑片中神经母细胞迁移的延时成像

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