急性片的成年小鼠前脑的神经细胞迁移的延时成像

我们描述了一个协议，用于在小鼠前脑的神经细胞迁移的实时videoimaging。病毒标记的或接枝的神经元前体的迁移，在急性活片，使用具有较快的采集间隔的宽视场荧光成像研究细胞迁移的不同阶段，其中包括固定和迁移阶段的持续时间和速度的记录迁移。

该程序的总体目标是研究成年小鼠四脑急性切片中的 Neuroblast 迁移。这是通过在神经母细胞标记后 5 到 8 天首先标记成人脑室下区的神经元前体来实现的，为大脑准备小鼠的急性切片。接下来，进行神经母细胞迁移的延时成像。

最终，宽场实时显微镜用于显示急性切片中神经母细胞迁移的动力学。该方法可以通过研究涉及细胞迁移的不同分子线索和细胞机制的作用来帮助回答神经元发育领域的关键问题。现在这种方法可以提供对调节成人大脑神经迁移的生理过程的见解，但它也可以应用于其他系统，例如研究缺血性大脑和胚胎发育过程中的神经迁移。

通过准备基于蔗糖的人工脑脊髓液来切割切片和基于 32 摄氏度氯化钠的 A CSF 以维持切片直至成像，然后通过连续用 95% 氧气、5% 二氧化碳鼓泡溶液来充氧。接下来，使用氯胺酮甲苯噻嗪内部用荧光标记的神经母细胞麻醉小鼠。然后使用液氮快速制备具有果冻状外观的冰冷切割溶液。

之后，用 15 cc 注射器吸取 20 至 20 毫升冰冷切割溶液，并在 Cardi 内灌注小鼠。如果需要标记血管而不是用切割液灌注，注射 200 微升浓度为 10 毫克/毫升的葡聚糖德克萨斯红，经 Cardi 进入心脏左心室，等待两到三分钟后再经心脏灌注后将小鼠斩首，将小鼠快速斩首，将头部浸入冰冷切割溶液中，并将其移至颤音处。用剪刀沿着矢状缝线从小脑到嗅球剪断颅骨。

随后，使用一对镊子轻轻取出颅皮瓣 然后，用手术刀切除大脑的 coddle 部分。然后在每个半球的最外侧部分做两个矢状切口，并沿着半球内裂切开大脑。然后用抹刀轻轻取出大脑，将其放入冰冷切割溶液中。

将两个半球分别放在 4% 琼脂块上，背面接触琼脂。接下来，将两个半球横向切割面的块粘在 Vibram 的平台上，内侧朝上。之后，将平台放入 Vibram 腔室中。

用切割溶液填充它。然后用 95% 氧气、5% 二氧化碳鼓泡，使溶液在整个切片制备过程中保持充氧。现在用振动器准备 250 微米厚的部分。

应使用低切割速度和高频刀片振动以获得高质量的截面。从刀片中释放切片后，轻轻将其从切割溶液中取出，并将其放入充满含氧 A CSF 的培养室中，在水浴中保持在 32 摄氏度。在此过程中，小心地将切片放在显微镜的成像室中，以避免切片在成像过程中漂移。

小心地在上面放一个尼龙网来稳定它。确保切片持续灌注 A CSF。接下来，使用 10 x 物镜查找感兴趣的字段。

打开 metamorph 软件并确定尼龙网不会阻碍成像区域。然后启用 40 倍物镜并调整焦距。确保目标和切片之间有足够的解决方案。

使用 metamorph 软件设置延时采集参数，例如激发持续时间、Z 平面数、每个 Z 部分之间的距离、时间间隔和录制持续时间。然后开始 Time lapse 采集。数据由 Metamorph 自动保存为 tiff 文件，每个文件对应一个获取的延时视频的时间点，以在 Mrs.Load

视频的第一个时间点图像拖放到程序图标中即可。加载动画后，在显示调整窗口中调整信号的亮度和对比度。在图片属性中设置采集的视频参数，如体素大小、时间间隔等，并设置等距时间点窗口。

指定体素大小后，可以在 3D 中查看帧以及视频的时间和比例，以自动跟踪录制的单元格。通过选择点函数，为超出窗口中字段中的每个细胞创建一个点，测量要在切片窗口中跟踪的细胞的直径。设置跟踪参数并继续。

检查检测到的对象随时间推移的可靠性。如果未自动检测到所有迁移细胞，请更改检测阈值并确保在所有时间点都选择了带有斑点的所有细胞。必须指定代表同一轨迹的相邻时间点的两个点之间的最大距离和最大间隙大小，以便程序可以连接这些时间点。

制作曲目后，只需删除它们即可过滤它们并删除不相关的曲目。可以通过连接和断开同一轨道的不同轨道和不同时间点来校正轨道 一旦完成了所有校正。最后查看轨迹并将数据（包括每个时间点的单元格位移、轨迹长度、位移长度和轨迹持续时间）导出到 Excel 文件。

该视频显示了绿色 Neuroblast 沿葡聚糖、德克萨斯州红色标记血管迁移的延时成像。请注意，当迁移期被静止期打断时，迁移的神经母细胞表现出盐化行为。该视频展示了 imas 软件对神经母细胞迁移的跟踪。

球体和线条分别表示单个单元的单元体和迁移轨迹。在尝试此程序时，重要的是要记住，应获得成年小鼠前脑的高质量急性生命切片。此外，应小心放置尼龙网，使切片在成像室中保持良好稳定，以避免切片在成像过程中漂移。

A CSF 灌注速率的任何变化、不规则灌注或温度的剧烈变化都可能导致成像过程中焦平面漂移和变化。观看此视频后，您应该对如何记录和分析急性成体切片中的神经母细胞迁移有很好的了解。我们建议使用 15 到 30 秒左右的短医生间隔，以可靠地识别迁移期和稳定期的开始和结束。