Name: 利用人类纤维原细胞线粒体表型的监测领域的帕金森氏病 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 9 s
Description: 了解利用人类纤维原细胞研究帕金森氏病线粒体表型的活细胞成像方法。通过皮肤活检获取细胞，结合实时成像技术评估线粒体功能与形态变化，为神经退行性疾病机制研究提供重要模型。

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本工作获得了弗里茨·蒂森基金会（Fritz Thyssen Foundation，项目号 10.11.2.153，授予 R.K.）、德国研究基金会（DFG，项目号 KR2119/3-2 和 KR2119/8-1，授予 R.K.）、联邦教育与研究部（BMBF，NGFNplus；项目号 01GS08134，授予 R.K.）的资助，以及由慈善赫蒂基金会（Hertie Foundation）提供的博士生奖学金 [授予 L.F.B]。我们感谢 Carolin Obermaier 和 Julia Westermeier 在视频拍摄期间提供的支持。

1. 皮肤活检与人成纤维细胞的培养
<ol>
	<li>皮肤活检必须由经验丰富的医生进行。操作需在无菌条件下完成，并实施局部麻醉。常用的活检部位包括上臂内侧、肩部或下背部。</li>
	<li>可通过环钻活检取直径为4×4 mm或6×6 mm的组织样本，以获得足够用于培养人成纤维细胞的组织量。</li>
	<li>在无菌条件下将皮肤活检组织切成大小均等的小块，并分装至2–4个T25培养瓶中。每个培养瓶应包含2–3块表皮组织。培养基成分为含15%胎牛血清（FCS）、1.1%丙酮酸钠和1%青霉素/链霉素的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。表皮组织样本中首次有成纤维细胞长出的预期时间为1–2周。若出现生长困难，可添加成纤维细胞生长因子（5–10 ng/mL FGF2）以促进细胞生长。</li>
	<li>当细胞融合度达到50–70%时，可对原代人成纤维细胞进行冻存。不同细胞系达到50–70%融合度所需时间有所不同。成纤维细胞应使用含90% FCS和10%二甲基亚砜（DMSO）的冻存液进行冻存。</li>
</ol>
2. 活细胞成像显微镜用人成纤维细胞的制备
通常，使用人成纤维细胞进行实验时，应选择传代次数低于10代的细胞，因为多次传代后与衰老相关的改变可能会影响细胞特性。如有疑问，可采用β-半乳糖苷酶检测来评估相应细胞中衰老过程的诱导情况。一般情况下，不应使用已衰老的成纤维细胞（见上文）。此外，在比较多个细胞系时，应使用各细胞系相同传代次数的细胞进行实验。建议将具有相同遗传背景的患者与健康对照进行比较。然而，由于携带特定突变的患者有时较为罕见，可能只能纳入一名特定传代次数患者的皮肤活检样本以及多个对照细胞系；在此情况下，必须确保所有纳入细胞系的传代次数一致。当细胞融合度达到50–70%但暂无实验计划时，应将成纤维细胞冻存。
<ol>
	<li>实验第一天，用 PBS 缓冲液清洗贴壁的成纤维细胞一次。随后使用蛋白水解 DNase 酶的细胞解离溶液将细胞从培养瓶底部解离下来。即 AccuMax)</li>
	<li>计数细胞，并在4孔盖玻片（1.8 cm）的每孔中接种50,000–70,000个细胞2 每孔培养面积）。因此，对于8孔盖玻片，适宜的细胞数量为一半或略少（0.8 cm²）2 每孔培养面积）。为了进行真正的单细胞分析，接种的细胞数量应较少。培养腔无需特殊包被。</li>
	<li>24–48 小时后，可进行活细胞成像实验。确保活细胞成像显微镜配备有可控制温度和 CO₂ 的培养箱。2 水平。在图像采集期间，保持一种气氛 37 °C 和5% CO₂2 应予以维持。</li>
	<li>每项活细胞成像实验应至少独立重复三次。总共每种细胞系应成像不少于50个细胞。活细胞成像实验及后续离线分析均须在盲法条件下进行，以确保数据采集的无偏性。</li>
</ol>
3. 活体人成纤维细胞中线粒体功能的测定
对于通过线粒体膜电位（MMP）依赖性染料对线粒体功能进行常规检测，荧光激活细胞分选（FACS）是主要方法。然而，在人成纤维细胞中，常可观察到细胞自发荧光，其可能干扰实际染色信号，导致假阳性结果。随着成纤维细胞传代次数的增加，自发荧光通常会更加明显。因此，我们更倾向于采用活细胞成像显微镜来评估人成纤维细胞的线粒体功能。
<ol>
	<li>接种后24-48小时，将成纤维细胞在RPMI培养基中与50 nM的基质金属蛋白酶依赖性染料四甲基罗丹明乙酯（TMRE）共同孵育。该RPMI培养基应不含酚红，因为酚红可能对成像质量产生不利影响。应加入1.6 μM的Hoechst染料以显示细胞核。</li>
	<li>将细胞在避光条件下，于37 °C和5% CO2环境中孵育于制备好的染色液中15分钟。</li>
	<li>用不含酚红的RPMI培养基替换染色液。无需洗涤步骤，立即进行细胞成像。使用63倍放大倍数及共聚焦激光扫描显微技术（或可选使用Apotome技术的荧光显微镜）以定义单层细胞。成像过程中维持细胞处于37 °C和5% CO2环境。</li>
	<li>对成纤维细胞成像时，需特别注意荧光光源的曝光时间，因为TMRE染色容易迅速发生光漂白。应将合适的曝光时间设定在200至300 ms之间，且不得超过此范围。在标准化设置下进行图像采集至关重要，若不同细胞系之间的成像参数不一致，则无法基于荧光强度进行有效比较。</li>
	<li>由于光照后成像细胞周围特定半径区域会发生光漂白，因此下一个视野应与已光漂白区域保持足够距离。</li>
	<li>离线分析使用ImageJ软件（Wayne Rasband；美国国立卫生研究院，USA）进行。</li>
	<li>使用选择工具选中目标细胞。</li>
	<li>将图像转换为8位（图像 &lt; 类型 &lt; 8位）。</li>
	<li>使用“去斑点”功能减少非特异性噪声（处理 &lt; 噪声 &lt; 去斑点）。</li>
	<li>选择“查找表 - 火焰”模式（图像 &lt; 查找表 &lt; 火焰）。</li>
	<li>将阈值功能切换至“超出/不足”模式，并调整阈值（图像 &lt; 调整 &lt; 阈值）。</li>
	<li>选择“分析颗粒”选项，该功能将提供每个可检测线粒体颗粒的平均灰度值（分析 &lt; 分析颗粒）。将生成的结果列表保存为Excel表格文件。</li>
	<li>在Excel程序中打开结果文件，并计算线粒体结构平均灰度值的均值（在Excel结果列表中标识为“mean”）。</li>
	<li>若需生成表面图，可在“3D”插件部分选择“交互式3D表面图”插件。在此可进一步通过不同显示选项调整图形。将“原始颜色”更改为“光谱LUT”可为相应图形提供强度比例尺。</li>
	<li>除使用TMRE通过活细胞成像分析人成纤维细胞线粒体功能外，也可联合使用线粒体膜电位非依赖性染料Mitotracker Green FM与线粒体膜电位依赖性染料Mitotracker CM-H2XRos。同样，对于人成纤维细胞，推荐采用活细胞成像显微技术，但总体而言，该替代方法也已被用于其他类型细胞的FACS分析12。当采用此替代方法检测人成纤维细胞线粒体功能时，应执行第5节“活体人成纤维细胞中线粒体-溶酶体共定位的测量”中的步骤3-7。通过该方法可计算同时表达Mitotracker Green FM和Mitotracker CM-H2XRos信号的叠加区域，从而以功能线粒体占总线粒体的比例来反映线粒体功能水平。</li>
</ol>
4. 活体人成纤维细胞中线粒体形态的测量
<ol>
	<li>接种后24-48小时，在37 °C、5% CO2条件下，用含200 nM Mitotracker Green FM的RPMI培养基（无酚红）避光孵育细胞15分钟。应使用1.6 μM Hoechst染色以标记细胞核。Mitotracker Green FM是一种线粒体膜电位非依赖性染料，可染色所有存在的线粒体结构。</li>
	<li>用PBS轻柔洗涤细胞一次。</li>
	<li>向细胞中加入新鲜RPMI培养基（无酚红），并立即进行成像。使用63倍放大倍数及共聚焦激光扫描显微技术（或 alternatively 使用Apotome技术的荧光显微镜）以确定单层细胞。</li>
	<li>离线分析通过ImageJ软件进行。</li>
	<li>使用选择工具选取感兴趣细胞。</li>
	<li>将图像转换为8位（图像 &lt; 类型 &lt; 8位）。</li>
	<li>使用“去斑点”功能减少非特异性噪声（处理 &lt; 噪声 &lt; 去斑点）。</li>
	<li>使用卷积滤波器突出线粒体结构（处理 &lt; 滤波器 &lt; 卷积）。</li>
	<li>调整阈值，使信噪比适当（图像 &lt; 调整 &lt; 阈值）。</li>
	<li>使用“分析颗粒”选项，基于选定的像素大小自动识别线粒体结构（分析 &lt; 分析颗粒）。随后可计算多个线粒体参数，如面积、周长、短轴与长轴或圆形度。这些测量参数可自行设定（分析 &lt; 设定测量）。将结果列表保存为Excel电子表格。</li>
	<li>在Excel程序中打开结果文件。利用上述参数可进行线粒体形态学分析，包括定义线粒体网络分支程度的形态因子［公式：(周长2)/(4*PI()*面积)］以及定义线粒体长度的长宽比（公式：长轴 / 短轴）。</li>
</ol>
5. 活体人成纤维细胞中线粒体-溶酶体共定位的检测
<ol>
	<li>接种后24-48小时，在37 °C、5% CO2条件下，用含200 nM Mitotracker Green FM和100 nM LysoTracker Red DND-99的RPMI培养基（不含酚红）避光孵育细胞15分钟。使用1.6 μM Hoechst染色以标记细胞核。</li>
	<li>将培养基更换为新鲜的含100 nM LysoTracker Red DND-99的RPMI培养基（不含酚红）。该染料需在整个成像过程中持续存在。孵育后无需洗涤细胞，立即进行细胞成像。采用63倍放大倍数及共聚焦技术（或可选Apotome技术）以获取单层细胞图像。</li>
	<li>离线分析使用ImageJ软件进行。</li>
	<li>打开需分析共定位状态的两幅对应图像。</li>
	<li>将图像转换为8位（图像 &lt; 类型 &lt; 8位）。</li>
	<li>对两幅图像均使用“去斑点”功能（Process &lt; Noise &lt; Despeckle）以减少非特异性噪声。</li>
	<li>选择插件“JACoP”作为共定位分析工具，该工具可提供各通道的相关数值，并计算Pearson系数、重叠系数和Manders系数（Plugins &lt; JACoP）。</li>
</ol>
6. 代表性结果
活细胞成像技术可用于评估活体人成纤维细胞中的线粒体功能。在功能检测中，TMRE荧光信号与线粒体膜电位（MMP）相关。在正常的MMP条件下，TMRE荧光显著增强（图1A，上排）相比，在线粒体膜电位（MMP）降低的病理条件下图1A，下排）。该荧光强度通过计算每个线粒体结构的平均灰度值的均值来测定（图1B）。荧光强度可通过 ImageJ 软件进行测量。此处使用“交互式表面图”选项可展示不同的峰强度图1A，右侧）。
除了评估人成纤维细胞中的线粒体功能外，活细胞成像显微镜还可用于定义线粒体形态的多种参数。使用MitoTracker Green FM染料可不依赖线粒体膜电位（MMP）对线粒体结构进行可视化（图2），这对于确保将所有存在的线粒体结构纳入分析至关重要。利用ImageJ软件，基于二值化图像对形态进行分析，因为仅在二值化图像中才能评估线粒体形态参数（图2，“binary”）。有关线粒体形态分析的示例，包括形态因子（form factor）和长宽比（aspect ratio），最近已有发表6, 13。在活体人成纤维细胞中可测量的另一重要特征是线粒体结构的降解过程。该过程的第一步可通过活细胞成像显微镜中的线粒体-溶酶体共定位来评估。某些病理条件下会导致线粒体与溶酶体的共定位增加（图3A）。同样，使用MitoTracker Green FM对线粒体结构进行染色，且不受其相应MMP的影响。此外，使用Lysotracker Red DND-99染色可实现溶酶体结构的可视化。成像过程中必须保持Lysotracker Red染料的存在，因为洗涤步骤会降低信号强度，导致信号过弱而无法清晰观察。共定位表现为绿色（MitoTracker Green FM）与红色（Lysotracker Red DND-99）染色重叠所产生的明显黄色荧光信号（白色箭头，图3A），并通过计算Pearson系数来确定（图3B）。
通常，在使用 ImageJ 软件进行离线分析时，每张图像中显示一个细胞有助于避免定义特定兴趣区域（ROI）。
<img alt="使用TMRE进行线粒体膜电位的荧光强度分析、光谱图、柱状图。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4228/4228fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
 图 1. 通过活细胞成像技术检测活体人成纤维细胞中线粒体膜电位（MMP）的TMRE荧光信号。 （A）TMRE是一种荧光MMP依赖性染料，其荧光强度与MMP相关。Hoechst染料用于染色细胞核（蓝色）。在正常的MMP条件下（上排），TMRE荧光强度显著高于以MMP降低为特征的病理条件（下排）。荧光强度还以强度表面图形式展示。比例尺表示10 μm。 （B）对（A）中所示代表性成纤维细胞的统计分析。在病理条件下，线粒体的TMRE荧光强度低于正常MMP条件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4228/4228fig1large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。
<img alt="显示Hoechst和MitoTracker Green染色的细胞成像；用于分析的合并及二值化处理图像。" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
 图2. 利用活细胞成像技术测量活体人成纤维细胞中线粒体形态。使用MitoTracker Green FM（绿色）对线粒体结构进行可视化，因其不受线粒体膜电位（MMP）影响。Hoechst染料用于细胞核染色（蓝色）。通过ImageJ软件，可在二值化图像上对形态进行分析。比例尺为10 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4228/4228fig2large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="荧光显微镜，Mitotracker Green，LysoTracker Red，正常与病理状态，Pearson 相关系数图。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4228/4228fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
 图 3. 通过活细胞成像技术测量活体人成纤维细胞中线粒体与溶酶体的共定位。（A）使用 Mitotracker Green FM（绿色）标记线粒体结构，Lyostracker Red DND-99（红色）显示溶酶体结构。Hoechst 染料用于染色细胞核（蓝色）。在病理条件下，Lysotracker Red 与 Mitotracker Green 染色信号重叠产生黄色信号，表明共定位成功（白色箭头）。比例尺为 10 μm。（B）展示于（A）中的代表性成纤维细胞的统计分析。线粒体-溶酶体共定位程度越高，Pearson 相关系数值也越高。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4228/4228fig3large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。

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未声明任何利益冲突。

患者的皮肤成纤维细胞作为ex vivo模型，是表征疾病相关遗传缺陷的重要工具。此外，皮肤来源的成纤维细胞易于获取，并可在培养中扩增。因此，相较于肿瘤细胞系，来源于携带帕金森病（PD）相关遗传突变患者的原代细胞更具优势，因为它们不仅含有内源性的致病基因，还保留了患者完整的遗传背景。同时，已有研究表明，成纤维细胞能够反映神经退行性疾病过程中线粒体功能障碍的重要病理特征。本实验方案中描述的实验特别适用于通过活细胞成像技术研究线粒体表型，包括其功能、形态以及线粒体与溶酶体的共定位情况。由此，可对疾病的主要特征——即线粒体功能障碍及其后续非功能性细胞器的降解过程——进行有效的可视化和分析6, 13。线粒体功能和形态的改变通常是疾病病理变化的早期事件。例如，线粒体网络的碎片化增加可能是自噬和线粒体自噬过程增强的前提条件6,12。因此，线粒体与溶酶体的共定位有助于评估线粒体的降解（即线粒体自噬）6。共定位减少或线粒体在溶酶体中异常积聚，可能提示溶酶体降解通路存在缺陷，需通过调控自噬流加以验证6。在此背景下，ImageJ 软件作为一种重要的分析工具...

<table><tbody><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>52400-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，无酚红</td><td>Invitrogen</td><td>11835-063</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Invitrogen</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>成纤维细胞生长因子2（FGF2）</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>AccuMax（解离溶液）</td><td>聚丙烯酸</td><td>L11-008</td><td></td></tr><tr><td>Lab-TekTMII 培养皿式盖玻片</td><td>Nalge Nunc International</td><td>115382</td><td></td></tr><tr><td>四甲基罗丹明乙酯（TMRE）</td><td>Invitrogen</td><td>T-669</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green FM</td><td>Invitrogen</td><td>M-7514</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker CM-H2XRos</td><td>Invitrogen</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>Lyostracker Red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H-3570</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;表1. &lt;/strong&gt; 特定试剂与设备。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

利用原代人类成纤维细胞监测帕金森病领域中的线粒体表型

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是第二常见的运动障碍性疾病，影响超过60岁人群的1%1。由于衰老是最重要的风险因素，未来几十年PD的病例数将增加2。除了病理性蛋白质折叠和蛋白质降解通路受损外，线粒体功能和形态的改变也被认为是PD中神经退行性变的另一重要特征3-11。
经过在小鼠和人类癌细胞中多年的研究所 体外 用于解析帕金森综合征分子通路的模型，采用患者及相应对照来源的人成纤维细胞作为 离体 模型已成为一种有价值的研究工具，前提是需考虑其潜在的局限性。与永生化且较为人工的细胞模型不同，来自携带疾病相关突变患者的原代成纤维细胞显然更能反映人类疾病的某些重要病理特征。
本文阐述了获取皮肤活检样本、培养人成纤维细胞以及使用详细的显微技术方案来定义线粒体表型的实验流程。这些方法被用于研究与帕金森病（PD）相关的、涉及线粒体功能和动态变化的不同特征。ex vivo 条件下，可从功能、形态、与溶酶体（降解功能异常线粒体的细胞器）的共定位以及通过溶酶体途径的降解等方面对线粒体进行分析。这些表型对于识别帕金森病的早期征象具有重要意义，并可能早于携带致病基因人群的临床运动症状出现。因此，本文所介绍的检测方法可作为识别神经退行性病变病理特征的有力工具，并有助于制定帕金森病新的治疗策略。

携带帕金森病致病基因突变的患者成纤维细胞是一种易于获取的 离体 用于研究疾病相关表型的模型。活细胞成像技术可实现对活细胞中形态学和功能参数的动态观察。本文描述了人成纤维细胞的制备及其线粒体表型的后续监测方法。

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是第二常见的运动障碍性疾病，影响着超过60岁人群中的1%1。由于衰老是最重要的……

以下实验的总体目标是利用活细胞成像技术研究与疾病相关的线粒体表型，所用材料为人类成纤维细胞。首先获取皮肤活检样本并进行组织培养制备。在最初的两周内，人类成纤维细胞将从皮肤样本中开始增殖。接下来，将成纤维细胞消化脱离并接种至腔室盖玻片孔板中。24至48小时后，应用活细胞成像染料，通过活细胞成像技术评估线粒体功能、形态或自噬情况。最终，通过基于软件的图像分析，可揭示活体人成纤维细胞中线粒体的形态学和功能参数。与已有的细胞模型（如肿瘤细胞系）相比，使用携带疾病相关突变的患者来源的原代成纤维细胞的主要优势在于，成纤维细胞能够在不依赖外源性基因操作的情况下，基于内源性蛋白水平反映人类疾病的若干重要病理特征。这些技术有助于识别帕金森病的早期征象，例如线粒体功能和动态变化的异常，并有助于制定新的治疗策略。首先获取一份新鲜的组织活检样本，该样本应通过活检钻取法获得。将样本置于第一皿含PBS的培养皿中，随后通过将其转移至另外三个盛有PBS的培养皿中，完成三次洗涤步骤。将活检样本切成小块，用移液器将两到三块组织转移至一个T 25培养瓶中。单次活检可同时用PBS制备两到四个培养瓶。小心地将 PBS 替换为少量培养基，使样本能够附着在培养瓶底部。将细胞培养至成纤维细胞从表皮样本中开始长出。如果遇到生长困难，可添加成纤维细胞生长因子以促进细胞生长。当细胞融合度达到50%至70%时，细胞即可用于实验。若无后续实验安排，应将成纤维细胞冻存。因此，用PBS洗涤细胞后，更换为DNA的酶，并进行孵育。收集培养物中的悬浮细胞，用培养基离心。将所得的细胞沉淀重悬于含DMSO的FCS中，并置于异丙醇冻存盒中，在负80摄氏度条件下冻存。对人成纤维细胞进行实验时，通常应使用传代次数少于10代的细胞系。始终比较相同传代次数的细胞系，并理想地使用多个不同的遗传背景均一的细胞系与健康对照进行比较。实验开始时，先用PBS洗涤贴壁的成纤维细胞一次，然后加入蛋白酶类的DNA酶孵育，以释放细胞。使用计数板对细胞进行计数，并在每个未包被的四孔盖玻片培养板的孔中接种50,000至70,000个细胞。24至48小时后，可进行活细胞成像实验。确保活细胞成像显微镜配备有孵育装置，能够在图像采集期间控制温度和二氧化碳浓度。应维持 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养环境。使用共聚焦显微镜、激光扫描显微镜或荧光显微镜，结合此处所示的 aome 技术，以 63 倍或更高放大倍数对细胞进行成像。传代次数较多的成纤维细胞的自发荧光通常会干扰 fax 分析。因此，首选方法是活细胞成像。在细胞接种到腔室盖玻片后24至48小时进行显微镜观察，并由于MMP依赖性染料对光敏感，需在避光条件下更换为含该染料的培养基。将细胞避光孵育 15 分钟。然后用不含酚红的 PMI 培养基替换染色液。若为红色，请勿进行洗涤步骤，立即对成纤维细胞进行成像。通过为所有图像选择 200 至 300 毫秒之间的单次曝光时间，以避免光漂白。在标准化设置下进行图像采集非常重要，因为如果不同细胞系之间的设置不同，将无法基于荧光强度进行比较。首次成像阳性染色的成纤维细胞时，可观察到清晰的 TMRE 信号。成像此视野后，不可避免地会发生光漂白现象，请使用公开可用的 ImageJ 软件，将下一个视野与已光漂白区域保持足够距离。离线分析图像。首先使用选择工具选中你感兴趣的细胞。通过图像类型菜单将图像转换为8位图像。在图像菜单下使用D去斑功能以减少所有非特异性噪声。在图像菜单下选择查找表中的火焰条件。将阈值函数切换为“过-欠”函数，并调整阈值，直至线粒体结构清晰可辨。在“分析”菜单下，选择“分析颗粒”选项，以获得每个可检测线粒体颗粒的平均灰度值。将生成的结果列表保存为电子表格。接下来，创建一个表面图。在3D插件部分使用插件“interactive 3D surface plot”来生成图像。通过不同的显示选项调整图像，例如将原始颜色更改为光谱LUT，以提供合适图像的强度比例尺。在另一个程序中，打开电子表格并计算线粒体结构平均灰度值的均值，以测量成纤维细胞中的线粒体形态。24至48小时。在将细胞接种于腔室载玻片后，由于对光敏感，需将培养基更换为含有MIT tracker green的培养基。在弱光条件下，将细胞避光孵育15分钟。随后用PBS轻柔洗涤细胞一次，并更换为不含酚红的新鲜RPMI培养基。立即按照前一节所述方法对细胞进行成像。在对成纤维细胞进行成像以评估线粒体形态时，应注意设置合适的成像参数，以高质量地观察线粒体结构。注意调节正确的焦距，并选择适当的曝光时间。与之前的图像分析类似，使用相同的软件定义感兴趣区域。将图像类型转换为8位，并使用D去斑功能减少噪声。接着，在“处理”和“滤镜”菜单下，使用卷积滤波器突出线粒体结构。然后与之前相同，调整阈值，使信噪比处于适当水平。由于手动设置阈值是一个关键步骤，必须仔细观察原始图像文件，以确保图像处理的准确性。在“分析”菜单下，选择“分析粒子”选项，以根据选定的像素大小自动识别线粒体结构。随后可以计算多个线粒体参数，例如面积周长、短轴、长轴或圆形度。这些测量指标可在“分析”菜单下单独设置，将生成的结果列表保存为电子表格文件后打开即可。通过定义形态因子来分析线粒体形态，该因子用于指示线粒体网络的分支程度。同样，可以通过计算线粒体的长径比来评估成纤维细胞接种后24至48小时的线粒体-溶酶体共定位情况，此处应将参数更改为1。该操作需包括线粒体示踪剂（mito tracker）和溶酶体示踪剂（lyo tracker）。注意操作过程中需避光。将细胞置于避光条件下孵育15分钟。随后更换为不含酚红但含有相同浓度溶酶体染料的RPMI培养基。立即采用共聚焦成像或荧光显微镜观察，使用aome技术，其中红色信号指示溶酶体，绿色信号指示相应结构。可视化线粒体结构。线粒体与溶酶体的共定位呈阳性时，在离线分析后期由于两种单独染色信号的重叠而呈现黄色信号。选择感兴趣区域后，进行8位成像并选用Despeckle去噪选项，然后选择插件Jacob作为共定位分析工具。该操作会输出每个通道的数值，并计算 Pearson 相关系数、重叠系数和 Manders 系数。这些数值用于评估溶酶体与线粒体的共定位情况。其中，Pearson 相关系数用于衡量两个变量之间的线性关系。通过所述成像技术评估了活体人成纤维细胞中的线粒体功能。在功能检测中，TMRE 荧光信号与线粒体膜电位相关。在线粒体膜电位（MMP）正常的情况下，TMRE 荧光信号显著高于因 MMP 降低所致的病理状态下的信号。通过计算每个线粒体结构的平均灰度值的均值来测量该荧光强度。在 Image J 中使用交互式表面图选项，可展示用 MIT tracker 绿色染色的细胞中不同峰强度的示意图，线粒体结构的可视化与其相应的线粒体膜电位（MMP）无关。形态学分析基于二值化图像进行。线粒体与溶酶体的共定位通过使用MitoTracker Green FM染色的细胞确定。与LyoTracker Red DND 99的共定位由白色箭头标示。图像分析还被用于确定这些重叠随时间变化的皮尔逊系数。观看本视频后，您应能充分理解如何利用人体皮肤作为离体模型，作为表征神经退行过程中线粒体功能障碍主要病理特征的重要工具。

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科研

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Medicine

医学

利用人类纤维原细胞线粒体表型的监测领域的帕金森氏病

通过人皮肤钻孔活检样本进行成纤维细胞组织块培养的实验方案是一种技术上稳健且简单的方法，可在4-8周内获得皮肤细胞，并以较低的传代次数保存约1500万至2000万个细胞。...

皮肤穿孔活检组织块培养法获取原代人成纤维细胞

线粒体运输和形态异常与多种神经退行性疾病相关。本方案利用诱导性多能干细胞分化的前脑神经元，评估遗传性痉挛性截瘫中的线粒体运输和形态。该方案可实现对轴突中线粒体运输的表征及其形态学分析，有助于推动神经退行性疾病的机制研究。...

分析遗传性痉挛性截瘫患者来源的人诱导多能干细胞衍生神经元中的线粒体运输与形态

我们展示了与自动化成像和分析兼容的人诱导多能干细胞（hiPSC）培养及神经元分化的自动化流程。...

人诱导多能干细胞来源的皮层神经元和多巴胺能神经元的自动化生产及整合活细胞监测

本方案描述了将皮肤成纤维细胞转化为成肌细胞，并进一步分化为肌管细胞的过程。这些细胞系来源于患有神经肌肉疾病的患者，可用于研究病理机制以及测试治疗策略。...

直接重编程人类成纤维细胞为成肌细胞以研究神经肌肉疾病疗法

我们描述了一种详细的人诱导性多能干细胞来源的脑类器官的生成方案，及其在模拟线粒体疾病中的应用。...

用于线粒体疾病建模的人脑类器官生成

代谢适应对T细胞至关重要，因其决定了T细胞的分化、存续及细胞毒性。本文介绍一种优化的用于监测线粒体呼吸的方案 离体 展示经细胞因子分化的原代人T细胞。...

细胞因子分化的原代人T细胞中线粒体呼吸的实时监测

本研究报道了一种基于流式细胞术和两种荧光报告分子或抗体双重染色的新型方法，用于测量多种线粒体功能参数，以检测线粒体体积、线粒体膜电位、活性氧水平、线粒体呼吸链组成以及线粒体DNA的变化。...

人类诱导多能干细胞及其神经和胶质分化衍生物中多种线粒体参数的流式细胞术分析

本研究提出了一种基于免疫染色和图像分析的小鼠脑组织线粒体形态分析方法...

帕金森病模型中线粒体形态的组织学检查

本方案描述了人类中脑多巴胺能神经元的细胞培养，随后进行免疫染色，并通过获取的显微高内涵图像生成神经元表型谱，从而识别由遗传或化学调控引起的表型变化。...

人源干细胞衍生中脑多巴胺能神经元的表型分析

富含肌成纤维细胞的癌相关成纤维细胞（CAFs）存在于肿瘤间质中，在驱动肿瘤进展中发挥重要作用。我们建立了一种共移植肿瘤异种移植模型，用于从人乳腺成纤维细胞实验性地生成CAFs。本方案描述了如何建立获得促肿瘤发生能力的CAF肌成纤维细胞。...

从人乳腺成纤维细胞实验性生成癌相关成纤维细胞（CAFs）

了解利用人类纤维原细胞研究帕金森氏病线粒体表型的活细胞成像方法。通过皮肤活检获取细胞，结合实时成像技术评估线粒体功能与形态变化，为神经退行性疾病机制研究提供重要模型。

利用原代人类成纤维细胞监测帕金森病领域中的线粒体表型

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