激光伤害的斑马鱼胚胎骨骼肌
2013年1月30日
这里介绍的方法，包括精确的具有高能量的激光脉冲和随后的分析随时间的伤害和其恢复损伤的活斑马鱼胚胎。我们还展示了如何转基因标记的单或骨骼肌细胞可以被跟踪和激光损伤后。
该程序的总体目标是诱导对斑马鱼、胚胎骨骼肌的精确控制损伤，以研究肌肉再生过程。这是通过首先以马赛克方式对单个骨骼肌细胞进行基因标记来实现的。接下来，将选定的胚胎嵌入载玻片上由 trica 提供的 agros 中。
然后将胚胎置于显微镜下，并使用微点激光损伤目标肌肉细胞。最后，将胚胎从 agros 中取出，并在规定的时间内恢复。最终，可以获得结果，显示通过激光损伤和共聚焦显微镜检查改变肌原纤维组织。
我们今天介绍的方法与肌肉再生领域相关，但也可以应用于其他再生范式，例如鳍再生和斑马鱼 为了标记细胞，在普遍存在或任何细胞类型特异性启动子的控制下，用编码 GFP 或任何 GFP 融合蛋白的质粒注射一个细胞期胚胎。在发育过程中，GFP 在组织内以马赛克方式表达。在这个例子中，注射的质粒导致单个肌肉细胞在 GFP 中表达 α 肌动蛋白。
在 β 肌动蛋白启动子的控制下，孵育胚胎直至受精后 28 小时。接下来在装有荧光灯的解剖显微镜下检测肌动蛋白。GFP 克隆使用镊子包被胚胎，通过将 100 毫克 agros 在 10 毫升 E 3 培养基中煮沸，制成 1% 低熔点、10% 的 Trica 溶液和 E 3 培养基。
让溶液冷却至 39 摄氏度，加入 trica 至终浓度为 10%然后准备带有凡士林环的显微镜载玻片。在显微镜下将低熔点农用溶液加入凡士林环中后，将单个胚胎嵌入凡士林环内的低熔点农用液中。使用盖玻片，轻轻覆盖胚胎并平行于盖玻片，以获得完美的横向视图。
要准备微点激光器，请参阅微点激光器手册，了解有关如何设置和使用激光器的详细说明。结合显微镜，选择 CUMERIN four 40 激光染料以产生 435 纳米波长的激光束。使用 attenuation 滑块调整激光功率。
庆祝活动所需的激光功率应足够强，以便用单个脉冲打破玻璃表面。有关使用安装在显微镜目部中的 redle 调整激光器的更多详细信息，请参阅制造商的说明。专注于感兴趣的区域或细胞。
接下来，设置可视化样品所需的光线。然后根据所需的损伤程度，向目标区域发出一波或几波激光。受伤后，立即用移液管轻轻地将胚胎从 agros 中取出，然后将其放回蛋水中进行回收。
恢复所需的时间后，固定胚胎，进行免疫组织化学，并使用共聚焦显微镜进行分析。激光介导的损伤是在固定的一天大的胚胎上进行的 Acton 染色表明，一些激光脉冲可以产生一个小伤口，很容易通过表现为肌动线圈的受损肌原纤维来识别。更多的激光脉冲会导致体节严重受损，其中大多数肌原纤维在恢复 5 小时后被破坏。
肌动蛋白染色显示，小损伤部位内的肌原纤维已经恢复并跨越螨虫的宽度。我们发现恢复的速度取决于受损组织的大小，小损伤比大损伤愈合得更快。通过用针对 SERP one 的抗体对受伤组织进行染色可以获得更多信息，SERP one 位于恢复的肌松上。
在激光损伤部位的受伤肌肉细胞中，由红色螺栓指示，消融细胞的 GFP 荧光减少。该图表明，在损伤恢复阶段和抗体染色后，白色箭头所示的靶细胞根据其周围马赛克标记的细胞模式被识别，如黄色箭头所示。这里显示的方法允许人们随着时间的推移跟踪激光介导的损伤如何影响闪米特肌肉细胞。
实时记录细胞以评估激光损伤后最初几分钟内的即时影响。然后可以在任何所需的时间间隔内进行延时记录，以密切跟踪细胞如何在伤口周围重新排列。在这个实时成像示例中，黑色箭头表示激光在 30 HPF 时伤害闪米特肌肉的位置。
受损肌肉细胞的末端向黑色箭头左侧和右侧的螨状边界缓慢缩回。该方法可与其他技术（如 Q-R-T-P-C-R 或 Western Blot）结合使用，以确定基因表达或蛋白质表达的变化。但也可以进行延时分析来研究器官损伤后的免疫反应等。
所以这种方法确实有很多可能的应用。
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概述
本研究提出了一种使用高能激光脉冲在活体斑马鱼胚胎中诱导精确损伤的方法。研究重点是在诱导损伤期间和之后追踪基因标记的骨骼肌细胞，以了解肌肉再生过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 再生生物学
- 发育生物学
背景
- 斑马鱼是研究肌肉再生的有价值模型。
- 基因标记允许追踪个体肌肉细胞。
- 激光诱导的损伤提供了一种控制方法来研究恢复过程。
- 理解肌肉再生对人类健康有重要影响。
研究目的
- 诱导对斑马鱼胚胎骨骼肌的受控损伤。
- 研究肌肉再生过程。
- 分析损伤后肌原纤维组织的变化。
使用的方法
- 以马赛克方式对骨骼肌细胞进行基因标记。
- 将选择的胚胎嵌入琼脂中以稳定。
- 使用微点激光来靶向并损伤特定的肌肉细胞。
- 允许胚胎恢复特定时间，并通过共聚焦显微镜分析变化。
主要结果
- 成功在斑马鱼肌肉细胞中诱导精确损伤。
- 标记细胞的追踪显示出不同的恢复模式。
- 观察到损伤后肌原纤维组织的变化。
- 结果有助于理解肌肉再生机制。
结论
- 该方法允许对肌肉细胞损伤和恢复进行详细研究。
- 研究结果增强了对骨骼肌再生过程的认识。
- 这种方法可以应用于肌肉生物学的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Laser-mediated injury in zebrafish embryos provides a spatially and temporally controlled method to study muscle regeneration, enabling precise interrogation of therapeutic hypotheses in skeletal muscle repair. This approach supports target validation by allowing direct observation of cellular recovery dynamics and myofibrillar reorganization in a vertebrate model with high genetic tractability. The method enhances predictive confidence in preclinical models by generating quantifiable, reproducible injury phenotypes that can be correlated with molecular and functional readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by inducing controlled damage to specific skeletal muscle cells to assess regeneration mechanisms.
- Operational Value: Uses mosaic genetic labeling to track individual cell behavior over time, providing internal controls via contralateral tissue.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through direct visualization of myofibrillar disorganization and recovery using actin and SERP1 staining.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable injury phenotypes based on laser pulse number, enabling dose-response assessment of cellular damage and recovery kinetics.
- Operational Value: Integrates with confocal microscopy and immunohistochemistry to produce standardized, high-content readouts for assay validation.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness by allowing time-lapse imaging of cellular rearrangement and wound response dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system for studying skeletal muscle regeneration with direct applicability to human muscle injury and degenerative conditions.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating injury size with recovery speed, supporting mechanistic de-risking of regenerative therapies.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment through detection of molecular markers like SERP1 during myofibril recovery.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, offering a reproducible platform to assess muscle regeneration phenotypes before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise spatiotemporal control over muscle cell injury in a developing vertebrate system.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via laser pulse-dependent injury severity and confocal-based morphometric analysis.
- Analytics: Provides measurable readouts such as myofibrillar organization, GFP signal loss in ablated cells, and SERP1 expression patterns to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through conserved regeneration mechanisms observable in zebrafish embryonic muscle.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across regeneration studies, including fin and neuronal tissue models, due to standardized laser and embedding protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct, observable links between laser-induced injury and cellular recovery dynamics.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled laser parameters (wavelength, intensity, pulse number) and agarose embedding for consistent sample preparation.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in muscle regeneration pathways through quantifiable phenotypic readouts.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on recovery kinetics and molecular marker expression across injury severities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection for mosaic labeling, and laser safety protocols.
- Dependent on instrumentation including a micropoint laser system (435 nm), confocal microscope, and setup for brightfield/fluorescence visualization.
- Necessitates cross-team standardization for embryo staging, agarose embedding consistency, and laser calibration across users.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other tissue types or species, particularly regarding laser penetration and absorption characteristics.
- Practical limitations include embryo viability post-embedding and the technical challenge of targeting single cells in developing tissues, as noted in the protocol.
