Name: 体外实时成像在小鼠神经上皮单细胞分裂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 了解小鼠神经上皮单细胞分裂的体外实时成像方法。本研究利用时间推移共聚焦显微镜和胚胎切片培养技术，实现对神经上皮发育过程中单个细胞分裂的动态观察。该方法为发育神经科学研究提供了重要的细胞分析工具。

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本研究项目得到了美国复苏与再投资法案（ARRA）补充资助 5 R01 NS056380 的支持。额外的支持来自埃默里大学神经科学 NINDS 核心设施基金（P30NS055077）中的病毒载体核心实验室和显微成像核心实验室。我们感谢埃默里大学转基因小鼠与基因靶向核心实验室协助从 GENSAT 获得小鼠品系；感谢 Greg Pazour 提供稳定的 SSTR3-GFP IMCD3 细胞系；感谢 Bradley Yoder 提供 Sstr3-GFP 慢病毒载体。单克隆抗体由发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）提供，该库在 NICHD 的支持下建立，并由爱荷华大学生物科学系（爱荷华市，IA 52242）维护。所有动物实验均经埃默里大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）及生物安全委员会批准。

通过机械性颈椎脱位法处死成年小鼠。所有动物实验程序均经埃默里大学动物护理和使用委员会（IACUC）及生物安全委员会批准。
1. 胚胎制备
<ol>
	<li>杂交他莫昔芬可诱导的Cre品系CAGGCreER与dsRedCre报告品系（Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy）图1) 5,6为了监测子细胞中Shh反应的相对时间，将CAGGCreER和dsRed品系与Olig2-eGFP BAC转基因小鼠（Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat）杂交图1) 7,8.</li>
	<li>将他莫昔芬溶解于100%乙醇中，在胚胎发育6.5天（E6.5）时，按每40 g体重注射2.5 mg他莫昔芬的剂量对怀孕雌鼠进行腹腔注射，以在少量细胞中诱导Cre表达及dsRed标记。</li>
	<li>48 小时后解剖胚胎，使用荧光显微镜鉴定表达 dsRed 的阳性胚胎，将其转移至培养皿中，并观察单个细胞的分裂过程 离体 成像（见下文）。 </li>
</ol>
2. 小鼠全胚胎培养
<ol>
	<li>在含有 DMEM/F12 (1:1)、10% 新生牛血清和 1% 青霉素/链霉素（P/S）9 的预温洗涤液中解剖 E8.5 胚胎。</li>
	<li>解剖后立即将胚胎置于荧光显微镜下的 37 °C 加热载物台上，并鉴定其是否为 GFP 和/或 dsRed 阳性（见下文）。</li>
	<li>将最多 2 个胚胎转移至 500 μl 预平衡培养液中，该培养液含有 50% 来自雄性 Sprague-Dawley 大鼠的血清和 50% 不含酚红的 DMEM/F12 (1:1)，并补充 L-谷氨酰胺、1% 的 1 M HEPES（溶于 0.85% NaCl）以及 P/S9。</li>
	<li>在培养液上覆盖一层薄薄的平衡石蜡油（厚度 0.1 cm），以防止蒸发，并将含有胚胎的培养皿转移至 37 °C、5% CO2 的培养箱中。</li>
</ol>
3. 病毒感染
<ol>
	<li>为了标记神经上皮中的纤毛，向含有 E8.5 胚胎的 500 μl 平衡培养基液滴中加入 5–10 μl Sstr3-GFP 慢病毒（约 200 万病毒颗粒）。</li>
	<li>培养 18 小时后，将感染的胚胎转移至数滴洗涤培养基中，以洗去病毒，并准备神经管切片。</li>
</ol>
4. 用于活体成像的神经管切片制备
<ol>
	<li>使用0.025 mm微型刀具，在预热的洗涤液中解剖E8.5胚胎的神经管，操作在1%琼脂包被的培养皿中进行。</li>
	<li>将分离出的神经管腹侧朝下放置于35 mm多聚-L-赖氨酸包被的玻璃底培养皿中，培养液滴体积为150 μl，使用不含酚红的平衡培养基。</li>
	<li>在已固定的神经管周围滴加少量由100%纯凡士林与熔化的蜡烛蜡（宜家蜡烛）按1:1比例混合而成的混合物，并用一小条窄玻璃盖片轻轻按压，以固定样品。</li>
	<li>在培养皿上覆盖一层薄的平衡轻质矿物油（厚度约0.1 cm）（图2）。</li>
</ol>
5. 活细胞成像与共聚焦显微镜时间序列观察
<ol>
	<li>将培养皿置于配备环境控制舱的尼康A1R激光扫描共聚焦倒置显微镜下，环境控制舱调节温度至37 °C，并维持5% CO2。</li>
	<li>使用60倍油镜记录GFP标记的纤毛和dsRed阳性细胞，同时使用40倍油镜监测Olig2-GFP和dsRed阳性细胞。</li>
	<li>打开NIS Elements软件以设置延时成像条件。每10分钟采集一次z轴层扫图像，扫描深度最多25 μm，层间距为1.5 μm（40倍物镜），或最多8 μm，层间距为0.4 μm（60倍物镜）。根据需要使用488 nm和561 nm激发波长以及透射光通道。图像采集尺寸设为512 × 512。设置多个用户自定义的兴趣区域，以实现同步记录。 
	通过使用低激光强度（mCherry 561不超过11%；EGFP 405/488不超过4.5%）、扫描速度1、线平均2以及针孔尺寸（dsRED为61 μm；Olig2为28.1 μm；SSTR3GFP为72 μm；dsRED和SSTR3GFP共用为61.3 μm；dsRED和Olig2共用为58 μm），优化激光功率和图像亮度。利用基因编码的荧光报告分子，可在低激光功率下检测到足够的荧光信号强度。</li>
	<li>使用Imaris 3D重建软件分析所记录的数据。</li>
</ol>
6. 免疫荧光
<ol>
	<li>在冰上（4 °C）的玻璃皿中，用 4% 多聚甲醛 / 0.1 M 磷酸盐缓冲液固定胚胎或分离的神经管，固定 1 小时。</li>
	<li>在冰上（4 °C）用 PBS 洗涤样品 2 小时（期间更换 PBS 数次），然后转移至 30% 蔗糖 / 0.1 M 磷酸盐缓冲液中过夜，直至胚胎沉底。</li>
	<li>包埋于 OCT 包埋剂中，干冰上速冻，-80 °C 保存。使用恒冷切片机进行切片（厚度 10 mm）。</li>
	<li>在含 1% 热灭活羊血清和 0.1% Triton X-100 的 PBS 洗涤液中洗涤载片 10 分钟。</li>
	<li>将一抗按以下浓度稀释于洗涤液中：大鼠单克隆抗 RFP 抗体（5F8,）1:200；兔抗 Arl13b 血清 1:1500 和小鼠单克隆抗 Arl13b 抗体 1:5（295B/54）；兔抗 Olig2 抗体 1:300；小鼠单克隆抗体 Pax6、Shh 和 Nkx2.2 均为 1:10；以及兔多克隆 Ki67 抗体 1:500。每张载片加入约 150 μl，置于水平加湿腔内，用封口膜覆盖以防止干燥，4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>用洗涤液在室温下洗涤载片三次，每次 20 分钟。</li>
	<li>将二抗 Alexa Fluor 488、568、350 按 1:200 浓度稀释于洗涤液中。用 Hoechst 1:3,000 或 TO-PRO-3 1:500 对细胞核进行染色。每张载片加入 150 μl，室温避光孵育 1 小时，置于加湿腔内。</li>
	<li>用洗涤液在室温下洗涤载片两次，每次 30 分钟。</li>
	<li>用 80% ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂封片，并在 24 小时内观察。</li>
</ol>

<ol><li>Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+neural+tube%3A+motor+neuron+induction+by+diffusible+factors+from+notochord+and+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate.</a> Cell. 73, 673-686 (1993).</li>
<li>Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+induces+the+differentiation+of+ventral+forebrain+neurons%3A+A+common+signal+for+ventral+patterning+within+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube.</a> Cell. 81, 747-756 (1995).</li>
<li>Briscoe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeodomain+Protein+Code+Specifies+Progenitor+Cell+Identity+and+Neuronal+Fate+in+the+Ventral+Neural+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube.</a> Cell. 101, 435-445 (2000).</li>
<li>Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ciliary+localization+sequences+within+the+third+intracellular+loop+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors.</a> Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).</li>
<li>Vintersten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+red%3A+red+fluorescent+protein+expression+in+mouse+ES+cells%2C+embryos%2C+and+adult+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals.</a> Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).</li>
<li>Hayashi, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombination+in+diverse+tissue+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre%3A+a+tool+for+temporally+regulated+gene+activation%2Finactivation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.</a> Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).</li>
<li>Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig2%2B+neuroepithelial+motoneuron+progenitors+are+not+multipotent+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).</li>
<li>Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li>
<li>Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+individual+cell+divisions+in+mouse+neuroepithelium+shows+asymmetry+in+cilium+formation+and+Sonic+hedgehog+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response.</a> Cilia. 1 (6), In Press (2012).</li>
<li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们的ex vivo系统使我们能够实时直接观察发育中神经上皮内的单个细胞分裂。作为示例，我们检测了小鼠胚胎神经管内的细胞分裂，并监测了纤毛形成或Shh反应。我们证实了成像结果（n = 24）与固定切片的结果（n = 178）一致，表明该技术可提供具有生理相关性的数据。
我们的技术依赖于Cre诱导仅限于部分细胞，因此他莫昔芬的剂量必须精确。我们已确定了用于标记单个细胞的给药方案。根据对CAGGcreER品系的初步分析，我们认为只需略微增加剂量即可轻松标记小群细胞，该品系显示对他莫昔芬具有剂量依赖性反应6。此外，胚胎培养条件至关重要，若条件不当会导致发育异常。我们已证实，在本研究采用的培养条件下，胚胎发育正常，该培养体系已知至少可支持36小时的正常发育11。
我们所使用的可诱导 Cre 及 Cre 报告基因小鼠品系均为公开可获取资源，研究人员可轻松获得，因此该技术具有较强的适应性，适用于解决多种科学问题。本技术的真正优势在于，通过...

<table><tbody><tr><td>Z/RED 品系（STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J</td><td>杰克逊实验室</td><td>005438</td><td></td></tr><tr><td>Olig2-eGFP 品系（STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd</td><td>MMRRC</td><td>010555-UCD</td><td></td></tr><tr><td>CAGGCreER</td><td>杰克逊实验室</td><td>003724</td><td></td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>新生牛血清</td><td>Lonza</td><td>14-416F</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>雄性 SD 大鼠血清</td><td>Harlan Bioproducts</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>1M Hepes</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>轻质矿物油</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Sstr3-GFP 慢病毒</td><td>Emory 病毒核心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型刀片，0.025 mm 规格</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 聚-L-赖氨酸包被的玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>100% 石蜡油</td><td>Kroger</td><td>FL9958c</td><td></td></tr><tr><td>A1R 激光扫描共聚焦倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements 软件</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 3D 软件</td><td>Bitplane AG</td><td>Imaris 7.2.3</td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>热灭活绵羊血清</td><td>Invitrogen</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大鼠单克隆抗 RFP 抗体（5F8）</td><td>Chromotek</td><td>110411</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 Arl13b 血清</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 Arl13b 抗体 1:5</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗 Olig2 抗体</td><td>Chemicon</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆 Pax6 抗体</td><td>发育杂交瘤库</td><td>Pax6</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆 Shh 抗体</td><td>发育杂交瘤库</td><td>5E1</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆 Nkx2.2 抗体</td><td>发育杂交瘤库</td><td>74.5A5</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆 Ki67 抗体</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568</td><td>Molecular Probes</td><td>A11031</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst</td><td>Fisher</td><td>AC22989</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo 活体成像小鼠神经上皮中的单细胞分裂

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

我们开发了一种系统，可对荧光标记物进行活体成像，并同时培养小鼠胚胎神经上皮组织切片。我们利用了现有的小鼠品系实现遗传性细胞谱系示踪：一种他莫昔芬诱导型Cre品系和一种在Cre介导重组后表达dsRed的Cre报告品系。通过使用较低浓度的他莫昔芬，我们能够在少量细胞中诱导重组，从而追踪单个细胞的分裂过程。此外，我们还利用Olig2-eGFP转基因小鼠品系观察了对音猬因子（Sonic Hedgehog, Shh）信号通路的转录响应。 1-3 通过感染表达纤毛标志物 Sstr3-GFP 的病毒，我们监测了培养脑片中纤毛的形成 4为了对神经上皮进行成像，我们在胚胎发育第8.5天（E8.5）取材，分离出神经管，将神经组织切片置于适宜的培养条件下并固定于成像腔室中，随后进行延时共聚焦显微成像。我们的 离体 活体成像方法能够以生理相关的方式追踪单个细胞分裂，从而评估初级纤毛形成与Shh反应的相对时间。该方法可便捷地结合不同的荧光标记物使用，为研究领域提供了监测细胞行为的工具 原位 实时地

在此，我们进行了 离体 E8.5小鼠神经上皮中单个细胞分裂的活体成像。为了标记单个细胞，我们在部分细胞中诱导了Cre重组酶，这些细胞来自携带Cre报告基因的小鼠品系，该报告基因在发生重组后可表达dsRed 5,6(图3A因此，48小时后我们能够观察到单个细胞的分裂过程 离体 成像（图 4A-D）。同时，我们通过引入一种经修饰的Shh转录报告BAC转基因Olig2-eGFP品系，监测标记细胞何时开始对Shh产生响应。图3C-D; 图4G-N) 1-3为观察纤毛形成，我们构建了Sstr3-GFP慢病毒用于感染培养中的胚胎（图3B; 图 4A-D) 4免疫荧光实验用于验证 体内 结果（图4E-F).
表达 Olig2-eGFP 或感染 ...

在此，我们开发了所需的工具 离体 活体成像示踪小鼠E8.5神经上皮中的单细胞分裂

我们开发了一种系统，可整合胚胎小鼠神经上皮切片的活体成像与荧光标记物的实时观察。我们利用了……

本实验的总体目标是将荧光标记物的活体成像与小鼠胚胎神经上皮组织切片培养相结合。首先通过将可诱导型Cree小鼠品系与Cree报告基因小鼠品系杂交，实现对可见分裂细胞进行遗传标记。随后，分离完整的小鼠胚胎，并在体外培养体系中加入慢病毒进行培养。随后对胚胎进行切片，并制备神经管切片用于活体成像。最后，利用延时共聚焦显微镜对神经管切片进行成像。最终，可通过体外活体成像技术实时直接观察发育中神经上皮内的单个细胞分裂过程。该实验方案的优势在于，我们可以在活体中监测单个细胞，从而能够研究每个细胞的信号事件及其行为。首先，将他莫昔芬诱导型Cree小鼠品系CAGG CRE ER与DS Red Cree报告品系杂交。为了监测子代细胞中音猬因子（sonic hedgehog）应答的相对时间，将CAGG CRE ER ds red品系与OG2 EEG品系杂交。FP 回交转基因小鼠将他莫昔芬溶解于100%乙醇中，随后在E6.5天对怀孕雌鼠进行腹腔注射，以诱导CRE表达并在少量胚胎细胞中实现DS red标记。48小时后，解剖胚胎，使用荧光显微镜鉴定DS red阳性的胚胎。将其转移至培养皿中，并在离体成像过程中观察单个细胞的分裂过程。将 E 8.5 胚胎解剖至预热的洗涤液中，洗涤液为 D-M-E-M-F 12 培养基与新生小牛血清按 1:1 比例配制，并添加 10% 新生小牛血清和 1% 青霉素-链霉素。使用带有 37 摄氏度加热载物台的荧光显微镜，或在 37 摄氏度加热板旁操作，立即鉴定出 GFP 和/或 DS RED 阳性的胚胎。将最多两个胚胎转移至 500 微升预平衡的培养液液滴中。在培养基上覆盖一层薄薄的已平衡的轻质矿物油，以防止蒸发，并将含有胚胎的培养皿置于37摄氏度和5%二氧化碳环境中孵育。为标记神经上皮中的纤毛，向含有胚胎的500微升已平衡的培养基液滴中加入5至10微升的S sst、R 3G FP慢病毒（约200万个变异体）。培养18小时后，将感染的胚胎转移至数滴洗涤培养基中，以洗去病毒，随后制备神经管切片。将胚胎转移至经1%琼脂包被的培养皿中，使用0.025毫米显微解剖刀解剖神经管。在经多聚赖氨酸包被的35毫米玻璃底培养皿中，加入150微升不含酚红的平衡培养液液滴，将分离出的神经管腹侧朝下置于液滴中。在固定好的神经管周围滴加少量石蜡油与熔化石蜡按1:1比例混合的混合物，并轻轻将盖玻片压入混合物中，以固定样品。用一层平衡好的轻质矿物油覆盖培养皿以进行成像。使用配备环境控制舱的倒置共聚焦显微镜，将温度设置为37摄氏度，二氧化碳浓度设置为5%。采用60倍油浸物镜对GFP标记的CLIA细胞和DS红阳性细胞进行成像，同时使用40倍油浸物镜。为监测 LIC 中两个 GFP 和 DSRed 阳性细胞，打开 NIS 元素软件以设置延时成像条件。每 10 分钟获取一次 Z 轴序列图像，使用 40 倍物镜时，Z 轴扫描厚度达 25 微米，步距为 1.5 微米；使用 60 倍物镜时，Z 轴扫描厚度达 8 微米，步距为 0.4 微米。更多操作说明请参见文本方案。将组织用 OCT 包埋固定后，使用冷冻切片机制备切片，并根据文本方案进行免疫荧光染色。在此，我们对 E 8.5 小鼠神经上皮中的单个细胞分裂进行了离体活体成像，以标记单个细胞。我们通过在包含 Cre 报告基因小鼠品系的细胞亚群中诱导 CRE 重组酶表达，在重组后表达 DS red，如图所示；48 小时后，通过包含 sonic hedgehog 转录报告基因并改良回交转基因 oli two EGFP 品系，经离体成像观察到单个细胞的分裂过程。我们能够监测细胞何时对音猬因子（sonic hedgehog）产生响应，以观察CLIA的形成。生成了SST R 3G FP慢病毒并用于感染培养中的胚胎。此处展示的是在体外培养期间表达EGFP、EGFP或感染SSTR 3G FP慢病毒的DS Red Cree报告胚胎的时间推移共聚焦成像结果。该方法的一个优势在于，我们可以将突变的遗传等位基因引入背景中，从而探究特定基因对单个细胞行为及信号事件的影响。

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科研

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神经科学

体外实时成像在小鼠神经上皮单细胞分裂

长时间实时成像胚胎组织具有挑战性。本文介绍一种可在较长时间内以高空间和时间分辨率监测鸡胚脊髓中细胞及亚细胞水平变化的检测方法。该技术可适用于神经系统及其他胚胎发育区域的研究。...

发育中的神经上皮内细胞行为的高分辨率活体成像

来源：Daynac, M., et. al．从小鼠成年脑室下区分离神经干细胞与前体细胞及其细胞周期动态的活体成像．J. Vis. Exp.

小鼠神经干细胞分裂的共聚焦显微镜延时成像

来源：Ing-Esteves, S. &amp;#38; Lefebvre, J. L. 利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向视网膜细胞群体进行神经元树突发育的延时成像。J. Vis. Exp.

小鼠视网膜外植体中神经元树突动态的延时共聚焦成像

神经母细胞迁移是出生后神经发生过程中的基本事件。我们描述了一种通过高效标记神经母细胞的方案 体内...

体内 新生期电穿孔与小鼠急性脑切片中神经母细胞迁移的实时成像

本方案描述了如何在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

可视化神经母细胞胞质分裂过程 秀丽隐杆线虫 胚胎发生

神经前体细胞的有丝分裂是神经发生过程中的一个关键参数。目前对神经前体细胞有丝分裂的大部分认识主要基于对固定组织的分析。在胚胎脑切片中进行活体成像是一种多功能的技术，可在受控环境中以高时间和空间分辨率评估有丝分裂过程。...

活体成像小鼠胚胎大脑皮层发育过程中的有丝分裂

本方案详细描述了一种用于完整幼虫大脑中活细胞成像的简化方法。活细胞成像技术对于研究不对称神经干细胞分裂以及其他神经发生和发育过程具有重要价值，能够持续揭示以往被忽视的机制。...

活体成像 黑腹果蝇 幼虫神经母细胞

我们报告了一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的方法，用于从成年小鼠脑的脑室下区（SVZ）分离神经干细胞（NSCs）及其子代细胞。该方法应用于荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）转基因小鼠时，可实现通过活细胞成像来研究细胞周期进程。...

成年小鼠侧脑室下区神经干细胞与前体细胞的分选及细胞周期动态的活体成像

本文提供了一种低成本且可靠的方法，可从小鼠胚胎制备适用于共聚焦显微镜和活体成像技术的电穿孔脑组织切片培养物。...

Ex Utero 电穿孔及胚胎小鼠脑组织切片培养用于迁移性GABA能中间神经元的活体成像

离体活体成像是一种研究活体组织中细胞运动和相互作用动态过程的强大技术。本文介绍了一种利用双光子显微镜对培养的成年小鼠全门齿中的牙上皮细胞进行活体示踪的实验方案。...

使用 离体 活体成像技术研究小鼠牙齿更新过程中的细胞分裂与迁移

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

了解小鼠神经上皮单细胞分裂的体外实时成像方法。本研究利用时间推移共聚焦显微镜和胚胎切片培养技术，实现对神经上皮发育过程中单个细胞分裂的动态观察。该方法为发育神经科学研究提供了重要的细胞分析工具。

ex vivo 活体成像小鼠神经上皮中的单细胞分裂

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