单个肌纤维和成人骨骼肌卫星细胞的分离和培养

该程序的总体目标是从成年小鼠的 EDL 肌肉中分离和培养单个活纤维及其相关干细胞。这是通过首先使用不会损坏纤维的肌腱到肌腱解剖程序解剖 EDL 来实现的。接下来，进行肌肉消化以解开纤维，同时保留肌纤维干细胞关联，这是该协议的一个独特步骤。

在最后一步中，单个肌纤维被轻轻地彼此分离，同时通过顺序洗涤去除碎屑或超收缩纤维。最终，通过该技术分离的肌纤维可以保持在半静止状态，激活刺激最小，也可以在高血清培养基中培养用于研究卫星细胞活化和分化。近年来，使用培养的泥浆纤维已成为研究相关生理生态位中卫星细胞的激活、增殖和分化的一种非常有效的方法。

这种方法确实使我们能够在了解这些细胞在分子和细胞水平上的功能方面取得巨大进展。对于分离 EDL 的每只小鼠，准备五个塑料 60 毫米培养皿，用一层马血清移液管，将 4 毫米马血清放在培养皿上并旋转使其均匀涂层。然后取出马血清，吸出任何剩余的血清，让培养皿干燥至少 30 分钟。

半小时后，将 4 毫升洗涤剂加入 4 个盘子中。按以下方式标记菜肴，消化后肌肉，洗 1 个，洗 2 个，洗 3 个。将 4 毫升纤维培养基添加到剩余的纤维培养皿中。

使用前，将培养皿保存在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中。接下来，对于一种纤维分离，在显微镜下准备两个无菌移液器。用金刚石笔切割小口径移液器，制作大口径移液器，使开口足够大，以便整个肌肉被冲洗过。

第二支移液器是用于 MyFi作的小口径移液器。现在，使用火焰曲线（小口径移液器的尖端）对移液器进行火焰加热以平滑边缘并进行消毒。这将有助于在隔离期间处理单根光纤。

然后将两个移液器包被在马血清中。最后，请务必用 70% 乙醇清洁显微镜站和解剖工具。对于此演示，8 周龄转基因 SV 1 29 小鼠。

被安乐死。用 70% 乙醇喷洒后肢。然后将动物正面朝上固定在支撑板上。

这是更好地抓住后肢所必需的。接下来，切开肢体的整个长度并露出下面的肌肉。去除皮肤以及任何头发或毛皮。

使用细剪刀剪开围绕肌肉的薄筋膜，而不会损坏下面的组织。使用锋利的 cohan Vana 暴露 TA 和 EDL 远端肌腱。弹簧剪刀。

切断 EDL 和 TA 远端肌腱。接下来，在镊子的帮助下，抓住 TA 和 EDL 肌肉的肌腱，并巧妙地将肌肉向上拉向近端。此时，您应该能够清楚地看到 TA 肌肉下方的 EDL 肌肉。

现在通过向相反方向拉动两条肌腱，将 EDL 与 TA 肌肉分开。执行此作时避免拉伸 EDL 肌肉。因为这会损坏肌纤维。

暴露 EDL 肌腱。此时，切除 TA 肌以更好地观察近端肌腱可能会有所帮助。切断膝盖周围的一些结缔组织也可能有所帮助。

一旦肌腱清晰可见，使用锋利的 cohan Venus Spring 剪刀释放 EDL 肌肉。如果手术正确完成，如果 EDL 应该能够保持其细长的形式，一旦从肢体上取下，通过肌腱固定 EDL 肌肉，将其转移到预热的 2 毫升胶原酶溶液中，并在 37 摄氏度的水浴中孵育。重复该过程以分离第二个 EDL 并将其转移到同一管胶原酶中，以进行不均匀的消化。

第二个 EDL 的隔离应在隔离后 5 分钟内完成。第一次 EDL 孵育时间可能需要根据胶原活性、肌肉大小、动物年龄或肌肉状况进行调整。例如，具有大量纤维化组织的肌肉可能需要更长的潜伏期。

另外，请注意，在此期间的搅动已被证明会激活 S 细胞 在消化期间，定期检查肌肉以避免过度消化。当肌肉开始松弛并且肌纤维变得可见时，停止消化。使用大口径移液器，小心地将两块肌肉转移到预热的培养皿中。

使用 4 毫升洗涤介质时，必须避免过度消化，因为这会导致肌纤维过度收缩。要释放肌纤维，请使用大口径玻璃移液器用温热介质冲洗肌肉，直到纤维开始自然释放。不要 T 摩擦肌肉，因为这不可避免地会导致纤维受损。

继续释放肌纤维，直到达到所需的数量。不要将培养皿在室温下放置超过 10 分钟。将其放回培养箱中 5 分钟以重新平衡，然后再使用。

该培养物目前包含活的单肌纤维（长而闪亮的管状结构）、超收缩纤维（深色且短）和碎片的混合物。现在使用小口径移液器，将活的单根 MYOP 纤维转移到新的预蠕虫培养皿中。单独处理每根 myop 纤维。

如有必要，不要一次转移大部分肌纤维，而是将培养皿放回培养箱中 10 到 15 分钟以重新平衡培养基。在至少连续三次洗涤结束时，再转移单个 myop 纤维两次，以去除所有死去的 myo 纤维和碎屑。培养皿中应仅保留单个活的肌纤维用于培养或下游分析。

活纤维具有很长的形态。相反，超收缩纤维更短更粗。现在，在切换到培养基之前，将分离的肌纤维在洗涤培养基中孵育至少一小时。

在新的预热培养皿中，高培养基将允许卫星细胞活化以进行长时间培养。无论选择哪种培养基，Matrigel 都是合适的。在隔离时每隔一天更换一次。

在光学显微镜下观察时，每个 MyFi 上的卫星细胞在肌纤维表面上显示为微小的突起。如果肌纤维在富含血清的培养基中长时间维持，则主要在培养物中观察到完全分化的肌管。报告小鼠品系，如 MIFF 五 Cree Rosa YFP 系是研究肌肉再生过程的最佳工具。

来源于 Miff 5 Cree Rosa YFP 纤维培养物的 Myo 管表达 MIFF 5 报告基因 YFP。这表明肌肉再生需要激活 Miff 5。PAX seven Cree TD 番茄小鼠品系是另一个报告品系。

TD 番茄荧光信号仅由卫星细胞检测到，而 myON 细胞核明显为阴性。这表明转录因子 PAX 7 由肌肉干细胞独特表达，而不是由其分化的后代表达。Myo 纤维及其相关的卫星细胞可以固定在下游。

免疫荧光 PAC 7 阳性 myo D 阳性卫星细胞通常被认为是增殖定型肌肉祖细胞。他们将通过下调 PAC 7 完成分化程序，同时保持我的 OD 表达，或者通过下调我的 OD 并维持 PAC 7 表达来恢复静止。单纤维分离技术具有保留生理性肌纤维卫星细胞协会的独特功能。

该程序最关键的步骤是将 EDL 肌肉从肌腱解剖到肌腱。最少的纤维作还可以保持纤维的完整性和活力。单个 myop 纤维的成功分离取决于几个因素，例如胶原活性、肌肉状况或年龄。

最重要的是，从肌腱到肌腱的肌肉隔离可以保持纤维的完整性。此外，在整个过程中最少的纤维作可以提高存活率。