开发，扩展，在体内从人类胚胎干细胞（hESCs）监测人类NK细胞和诱导多能干细胞（iPS细胞）
April 23rd, 2013
本协议描述的发展，扩张和来自人类胚胎干细胞和iPS细胞的NK细胞在体内成像。
该程序的总体目标是从模糊、有效的干细胞中产生人类自然杀伤或 NK 细胞。这是通过首先生成造血祖细胞来实现的。在第二步中，造血祖细胞通过使用确定的细胞因子分化为 NK 细胞。
接下来，可以在各种功能测定中测试 NK 细胞。在最后一步中，使用双重成像来监测 NK 细胞在体内杀死肿瘤靶标的能力。与传统的现有方法（如基质细胞介导的分化或常规 EB 形成）相比，该技术的主要优点是多刺 B 系统为可以分化为自然杀伤细胞的祖细胞的大规模扩增提供了一种完全定义的无饲养层方法。
这项技术的影响扩展到慢性病毒感染和癌症的治疗，因为 NK 细胞已被证明是这两种疾病中的重要效应细胞。为了准备胚胎体或 EB 铺板，首先将 150 微升无菌水移液到圆底低附件 96 孔板的 36 个外孔中，以尽量减少蒸发。接下来，从胚胎干细胞和诱导多能干细胞培养物中吸出培养基，并加入 1 毫升 Prewarm 行程。
选择将含有板的旅行通道放入 37 摄氏度的培养箱中，然后在 5 分钟后，轻轻地将细胞从板中移出，将解离的细胞转移到锥形管中，并上下移液细胞溶液以分离任何团块。现在，用一个等体积的 BPEL 培养基和至少一个等体积的 DPBS 稀释 trip，并在 480 倍 G 和 8 摄氏度下将细胞旋转 5 分钟。然后去除上清液，将沉淀重悬于 5 毫升、BPEL 培养基加 5 毫升 DPBS 中。
再次离心细胞后，将沉淀重悬于 5 至 10 mL BPEL 培养基中，然后将细胞通过 70 微米过滤器放入新鲜的 50 mL 锥形管中，以去除任何团块。在计数并旋转过滤后的细胞 Resus 后，将上颚以 3 乘以 10 至每毫升板的第四个细胞，将 100 微升细胞放入先前制备的 96 孔板的内 60 个孔中，然后在 480 倍 G 和 8 摄氏度下旋转 96 孔板 4 分钟。然后，使用送至 100 微升的多通道移液器小心地将板放入 37 摄氏度的培养箱中。
通过将 6 个离心 EBS 转移到 24 孔板的每个孔中来开始下一步。然后向每个孔中加入 400 微升含有细胞因子的 NK 分化培养基，使每个孔中的总体积达到约 1 毫升。将细胞孵育 28 天，每 5 至 7 天用 NK 分化培养基（含有细胞因子的培养基）补料培养物。
在第 28 天，NK 细胞在转移到 NK 细胞分化培养物后将表达成熟表型。为了测试 NK 细胞的细胞毒性，进行 4 小时的铬释放试验，以产生大量 NK 细胞用于体内实验。使用 Sochi 等人先前演示的方案将细胞与人工抗原呈递细胞共培养。
通过Resus将所需数量的肿瘤细胞悬浮在200微升的cov修饰的delco培养基或补充有20%FBS的IM DM中来开始此步骤。然后使用 27 或 28 号针头，将肿瘤细胞皮下注射到每个 6 至 8 周龄的非肥胖糖尿病患者的左上胸部。严重的联合免疫缺陷与 γ 链敲除小鼠。
让肿瘤细胞移植四天。细胞应在小鼠皮肤下形成气泡。然后将所需数量的 HESC 衍生的 NK 细胞重悬于 300 微升 IMDM 中，补充有 20% FBS，不含抗生素。
接下来，使用新的 27 或 28 号腹膜内针头，将 HESC 衍生的 NK 细胞注射到每只患有肿瘤的小鼠中。然后，为了通过生物发光成像监测细胞的植入，向每只小鼠腹膜注射 120 微升 D 荧光素。麻醉小鼠后，在注射 D 荧光素后 10 分钟内将动物置于 IVUS 光谱中，使用魔术贴将每只小鼠固定在其背上，然后将 IVUS 机器设置到正确的成像平台。
现在将 benning 设置为中等，将 F 档设置为 1，然后采集图像 1 分钟，以对 Turbo FP 6 个 50 阳性细胞进行荧光成像。首先，使用成像向导设置发射扫描，以测量感兴趣的探头，以及探头列表中的背景信号。选择输入 EM ex，然后输入 605 作为激发，输入 660 到 720 作为肿瘤信号的发射。
然后选择 add probe 作为背景信号。将激发设置为 570，将发射设置为 640 到 720。过滤器也可以通过 filter config 按钮进行设置。
最后，让小鼠从麻醉中完全恢复，然后再将它们运回动物设施。可以使用 Living Image 软件包 4.2 版对图像进行分析。第 11 天，自旋 EBS 含有高百分比的表达 CD 34、CD 43、CD 45 和 CD 31 的祖细胞。
高水平的 CD 34 和 CD 45 允许直接转移到 NK 细胞条件，而无需分选或支持基质细胞。NK 细胞可以通过流式细胞术检测。经过四周的培养。
分析淋巴细胞步态内的细胞 CD 56 的表达。然后可以进一步分析 CD 56 阳性细胞与 CD one 17、CD 94 或 NK P 46 等标志物的共表达。NK 细胞维持被修饰到亲本 E-S-I-P-S 系中的报告基因的表达，因此可以在体内进行跟踪。
在这里，IVUS 光谱已被用于证明 NK 细胞和肿瘤细胞的同时成像。在萤火虫荧光素酶的同一小鼠生物发光成像中，HESC 衍生的 nnk 细胞在第 NK 细胞注射后第 7 天和第 14 天显示 turbo FP six 50 阳性 K 5 6 2 细胞在第 0 天、第 7 天和第 14 天的荧光成像。此处显示了 NK 细胞注射后，显示来自 turbo FP 的 6 个 50 阳性细胞的组织自发荧光和荧光信号的序列。
显示了在活体图像软件中使用光谱解混功能。这些小鼠是非注射对照，仅显示背景信号。在尝试这种技术时，重要的是要保持高质量的 ES 和 IPSL 培养，以及如上所述进行 DYS 棘 b 分化。
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概述
本协议描述了从hESC和iPSC衍生的NK细胞的开发、扩增和体内成像。该程序从有效的干细胞生成人天然杀伤细胞，允许进行功能性检测和体内监测。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 干细胞研究
- 免疫学
背景
- 天然杀伤（NK）细胞在免疫反应中起着至关重要的作用。
- 造血祖细胞对NK细胞分化至关重要。
- 使用已定义的细胞因子来促进分化过程。
- 传统方法通常依赖基质细胞或胚体形成。
研究目的
- 开发无饲养层的NK细胞扩增方法。
- 提高从干细胞生成NK细胞的效率。
- 实现对NK细胞对肿瘤活动的体内成像。
使用的方法
- 从干细胞生成造血祖细胞。
- 使用细胞因子将祖细胞分化为NK细胞。
- 功能性检测以测试NK细胞能力。
- 双成像技术用于监测体内NK细胞活动。
主要结果
- 成功从hESC和iPSC中分化出NK细胞。
- 在功能性检测中展示了NK细胞的有效性。
- 体内成像确认了NK细胞靶向肿瘤细胞。
- 无饲养层方法比传统技术显示出优势。
结论
- 该协议提供了一种可靠的NK细胞生成方法。
- 无饲养层扩增提高了可扩展性和效率。
- 体内成像是评估NK细胞功能的有价值工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Feeder-free derivation and expansion of NK cells from hESCs and iPSCs addresses a critical bottleneck in scalable, genetically modifiable immune effector production for discovery and translational research. This platform enables robust mechanistic interrogation and in vivo tracking of NK cell function, supporting predictive confidence in early-stage immuno-oncology and cell therapy pipelines. The dual-imaging capability further enhances translational continuity by enabling real-time monitoring of cell fate and tumor interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking of NK cell-mediated cytotoxicity in disease-relevant models.
- Supports functional target validation through quantitative in vitro and in vivo assays.
- Facilitates hypothesis-driven evaluation of genetic modifications in NK cells.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, feeder-free NK cell populations for reproducible assay development.
- Enables high-throughput functional screening of NK cell activity against tumor targets.
- Supports quantitative readouts via flow cytometry and dual-imaging modalities.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in vivo tracking of NK cell engraftment and function.
- Supports preclinical evaluation of adoptive NK cell therapies in xenograft models.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions through real-time monitoring of cell-tumor interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical validation, enabling seamless transition from in vitro mechanistic studies to in vivo efficacy and tracking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for NK cell function and genetic modification.
- Screening: Delivers assay-ready, scalable NK cell populations with reproducible phenotypes.
- Analytics: Provides quantitative flow cytometry and dual-imaging outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Enables in vivo monitoring of cell fate and tumor engagement, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, feeder-free platform for generating genetically modifiable NK cells across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in NK cell-based studies.
- Operational Value: Standardizes NK cell production and expansion, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making and capital efficiency in cell therapy and immuno-oncology pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of NK cell-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, differentiation, and flow cytometry analysis.
- Needs access to dual-imaging instrumentation and analytical software for in vivo tracking.
- Demands rigorous standardization of feeder-free culture conditions across teams.
- Adaptation may be needed for different genetic backgrounds or disease models.
- Dependent on maintenance of high-quality hESC/iPSC lines and precise cytokine-driven differentiation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Setting up TrypLE-passaged ES Cells into Stage I Spin Embryoid Bodies (EBs): Day of Spin EB Setup into Stage I Differentiation (Day 0)
3:16
Development, Expansion, and Characterization of NK Cells from hPSC-derived Progenitor Cells
4:19
In vivo Fluorescent and Bioluminescent Imaging to Monitor hESC-derived NK Cells and Tumor Cells in Immunodeficient Mice
6:50
Results: The Generation of Hematopoietic Progenitor Cells Using the Spin EB Approach Allows for Optimal NK Cell Development from hESCs and iPSCs
8:43
Conclusion
