建立真菌Entomopathogens作为内生菌:建立内生生物控制

Hi.My 叫 Ush Parsa，是国际热带农业中心 （International Center for Tropical Agriculture） SEA 的昆虫学家。我是来自国际热带农业中心的 ViiV Artiz，我是来自美国农业部的 Fernando Vega。本视频的总体目标是演示如何促进和验证真菌在病原体中的建立。

作为内生菌，在自然界中发现感染病原真菌的昆虫或螨虫是很常见的，使用这些真菌安藤病原体作为生物杀虫剂的历史由来已久。最近，偶尔发现真菌安藤病原体感染植物，但没有产生任何明显的症状。这一发现标志着它们可能用作针对农业害虫的保护性内生菌。

为了探索这种潜力，首先必须开发一种接种方法，该方法能够可靠地将真菌病原体建立为目标作物中的内生菌。B Bassiana 是研究最充分的真菌病原体之一，它很容易通过杀虫剂作为商业获得。这种真菌已被检测为许多植物物种的内生真菌，包括香蕉、咖啡和肉豆蔻。

最近证据表明，B bassiana 不仅有可能保护植物免受节肢动物害虫的侵害，而且有可能保护植物免受某些植物病原体的侵害。解释这种广谱保护的机制知之甚少。仍在抽动阀领域，对于缺乏对害虫或病原体的遗传抗性的作物来说，可能很有希望，但对于通常遭受多个敌人同时攻击的作物来说，常见的 fas vulgaris 就是一个典型的例子。

它可能受到 400 多种害虫和 200 种病原体的影响，这些病原体的攻击被认为是各地区最限制大豆生产因素。出于这个原因，我们认为常见的 be 可能是研究 Endo bbar 受保护潜力的良好候选作物。作为朝着这个方向迈出的第一步，Arvid 展示了叶面喷洒和土壤淋湿作为接种方法的功效，以将 Bana 确立为内生菌。

在普通豆种子中，将称为 TOMA 的豆种子在 0.5% 次氯酸钠中浸泡 2 分钟，然后在 70% 乙醇中浸泡 2 分钟，并在无菌蒸馏水中冲洗 3 次，以达到理论上的成功。将 100 微升冲洗水样品接种在装有 PDA 培养基的 100 毫米培养皿上，并在 25 摄氏度下避光孵育 10 天。如果在这些对照中观察到生长，则应中止并重新开始实验。

以 11.5 厘米宽的花盆中以三人一组的形式缝制，其中含有土壤和沙子的蒸汽灭菌混合物，比例为 2：1。植物在 25 摄氏度、50% 相对湿度和 12 小时光照周期的受控条件下生长，发芽后每周光照强度为 9， 200 勒克斯。植物很薄，每盆一株，以确保活力并消除竞争。

它们每 2 到 3 天根据需要进行一次灌溉，并在种植后 10 天和 20 天用每升 6 格兰特的 NPK 肥料水溶液施肥。为了确保我们真菌的遗传一致性，应该从单一的加拿大培养物中培养分离物。如果真菌的来源是患有真菌病的昆虫，我们将标本带到层流罩中，并使用接种环将一小块 DYS 孢子真菌样品转移到 PDA 培养基中。

一旦目标真菌在干净的培养物中生长并喷出，则可能需要随后转移到新的培养基板中以去除污染物。悬浮在一毫升 0.1% Triton X 100 水溶液和涡旋 tritton Exus 中的小 edia 样品是表面活性剂，可降低水表面张力并允许 kedia 分散。将这种悬浮液的 100 微升等分试样铺在 100 毫米的培养皿上，培养皿中含有 2.5% 贵英亩的薄层，这将允许在他们的立体镜上看到 kedia。

将板在室温下避光孵育 24 小时，然后将单个发芽笔培养基转移到带有 PDA 的培养基板中，并让其生长 3 至 4 周，直到覆盖整个培养基板和切片。该方法为后续实验提供了真菌的纯培养物。在本演示中，我们使用了 Bavaria Bassiana 的纯培养物，这是一种从商业产品 Microt 获得的菌株 GH HA。

接种物在无菌条件下制备。在层流罩中，我们使用无菌刮刀从培养基表面刮下大约 1 克真菌生长，并悬浮在 10 毫升无菌 0.1%Triton X 中，将悬浮液涡旋一分钟，并通过无菌粗棉布过滤以将加拿大与 Hy-Vee 分离。此步骤产生卡住的悬浮液，需要将其调整为每毫升 10 至 8 kedia 的最终浓度以进行接种。

首先，在便于计数 ketia 的连续稀释中估计原液的浓度。在 Hema 流式细胞仪中，将 100 微升原液稀释在 900 微升 0.1% Triton X 中并涡旋，得到 1/10 的稀释度。该程序连续重复 3 次，以获得 10， 000 分之一的稀释度。

Kedia 在第一次稀释时以极高的数量存在，而在最后一次稀释中以低数量存在，可以很容易地计数。Hema 细胞仪的两个腔室中的每一个都装有 10 微升 10， 000 分之一的稀释液，并置于显微镜下对 Kedia 进行计数。Hema 流式细胞仪的规则区域由 9 个大方块组成，每个方块分别容纳 100 纳升或 0.0001 毫升。

为了估计样品中 ED 的浓度，我们对每个腔室的四个大角方块中的 ED 进行计数和平均，然后将该平均值除以 0.0001。将此浓度乘以我们的稀释因子 10， 000 即可得出现在的储备液浓度，以计算储备液必须调整到的最终体积。为了获得每毫升 10 38 edia 的接种物，我们应用该公式。

最终体积等于储备液体积乘以储备液浓度与最终浓度之比。在我们的演示中，需要将原液调整到 195.5 毫升的最终体积，以产生我们所需的浓度。在使用接种物之前，进行发芽试验以评估根管活力非常重要。

对于该测试，我们将 100 微升 10， 000 分稀释液放在含有 2.5% 惰性鸡蛋或培养基的 100 毫米培养皿板上。将样品用无菌玻璃棒涂布到培养基表面，并在 25 摄氏度的黑暗中孵育 24 小时。通过估计胚管生长的 Kedia 的百分比，在显微镜下评估活力。

对于三个 100 加拿大的随机样本，只有当平均发芽率高于 90% 时，加拿大悬浮液才能用于接种。在这个演示中，我们发现平均发芽率为 97%我们将演示两种接种方法，叶面喷洒和土壤淋洒，这两种方法都是在植物达到第一个真叶期时应用的。种植后大约 14 天，叶面喷洒法使用手动雾化器将悬浮液引导到叶子的 al 或上表面，直到它们饱和。每个花盆的顶部都覆盖着铝箔，以避免圆锥形径流到土壤中 喷洒后，每株植物都用塑料袋覆盖 24 小时，以保持高水平的湿度，促进真菌的入侵。

土壤淋灌接种法是在土壤水容量下进行的。在给植物浇水至土壤饱和约 24 小时后，将 10 毫升 cial 悬浮液施用于土壤表面。在植物对照的底部接受 0.1% Tritton X 的无菌，其施用方式与相应的处理相同。

将植物放回生长室并以随机完全块状设计排列，每个处理重复三次。我们在接种后两周评估了建立，一次一个街区。这些植物经过精心采摘，并在每株植物的自来水中单独清洗。

我们从植物的第一片真叶中随机选择两片小叶、两片根和两片茎小叶取样，并修剪成方形茎。从植物的中部和土壤表面附近获得大约 3 厘米长的样本。从根的中间和根尖后面的 1 厘米处获得相似长度的割根样品。

每个样品在无菌罩中用 0.5% 次氯酸钠单独表面消毒 2 分钟，然后用 70% 乙醇消毒 2 分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗 3 次，然后晾干。在无菌毛巾纸中，然后仔细解剖灭菌样品，以丢弃其外边缘，因为内生菌可能因与消毒剂蚂蚁接触而被消除。然后将修剪后的样品切成更小的部分，叶子平均为 6 x 6 毫米，茎和根平均为 6 毫米长。

将切片接种在 60 毫米培养皿上，其中含有 PDA，补充有抗生素四环素（如链霉素）和青霉素，每升 2 毫克。最后，用石蜡密封板，并在 25 摄氏度的黑暗中孵育。冲洗水在处理每个模块后更换，但在将 100 微升样品接种在 100 毫米培养皿、PDA 培养基上并在 25 摄氏度下孵育 10 天以确定序列化是否成功。

如果在此控件中发现任何增长，则丢弃该块，不考虑进行分析。每 2 到 3 天检查一次板，持续 20 天，以观察和记录真菌生长。将定植的植物切片切除并单独转移到新的培养基板中，以避免污染相邻切片。

B bassiana 的生长是基于特征性的白色致密菌丝体在边缘变成奶油色至淡黄色。如有疑问，将样品安装在显微镜灯下的一滴水中，并在定植当天检查该物种的整体斯堪尼亚和锯齿形 kedia 力特征。我们还估计了我们的处理对植物生长的影响。

我们首先测量从植物基部到生长点顶部的植物高度。然后，我们小心地将植物连根拔起，用自来水清洗，让它们在 45 摄氏度下干燥三天，以测量它们的干重。对于此演示，我们进行了两次完整实验以获得具有代表性的结果。

两种接种方法都导致 Bana 在超过 80% 的处理植物中物理化。然而，定植程度取决于评估的植物部分和使用的接种方法。潜在客户的反应最好。

另一方面，喷雾接种根只对淋湿接种有反应。最后，茎对两种接种方法的反应相似。除了从 15% 的评估植物切片中分组的 Bana 之外，在任何独立于处理内生菌的受控植物切片中均未检测到 Bana，但它们在侵入相邻切片并影响我们的结果之前从培养基板中解剖出来。

接种后 2 周，处理植物和对照植物明显无法区分，并且在干重和高度方面未检测到显著差异。许多因素会影响实验的特定结果，从而将 endo 病原体确定为最终效果。正如该视频所示，接种方法是其中一种 要实验的生物因素包括选择的作物物种或栽培品种以及 OMA 病原体物种的选择或分离 考虑纵的其他因素包括接种物的浓度、接种期间植物的年龄和植物的生长条件。

这些实验的最终目标应该是开发一种有效的治疗方法，为抗 INE 或疾病提供持久的全身耐药性。当您准备好测试 Endof 战斗介导的耐药性时，我们建议您观看也发表在 Journal of Visualized Experiments 上的描述草药耐药机制的视频。请注意，内生真菌在植物中非常常见，它们可能会影响您持续建立和检测病原体目标真菌的能力。

我们希望这个演示有用。祝你的实验好运。