Name: 建立真菌Entomopathogens作为内生菌:建立内生生物控制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: 了解如何将昆虫病原真菌Beauveria bassiana作为内生菌引入菜豆(Phaseolus vulgaris)的两种接种方法。本研究为评估其在农业害虫生物防治中的潜力奠定基础。

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本文所述的实验工作和成果得益于雷纳尔多·帕雷哈（Reynaldo Pareja）的全力支持与热情帮助。本研究由哥伦比亚行政科学技术创新部（Colciencias）以及比尔及梅琳达·盖茨基金会通过“大挑战探索计划”资助。

1. 植物
<ol>
 <li>将菜豆种子（品种 Calima）浸入0.5%次氯酸钠溶液中2分钟，再浸入70%乙醇中2分钟，进行表面灭菌。随后用无菌蒸馏水冲洗种子三次。</li>
 <li>取最后一次冲洗液100 μl涂布于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，于25 °C培养10天，以评估灭菌效果。若平板上出现任何微生物生长，则终止实验并重新开始。</li>
 <li>将种子每三粒一组种植于含有无菌土壤与沙子（2:1比例）混合物的花盆中。将花盆置于25 °C、相对湿度约50%、12小时光周期的生长室中。种子萌发一周后，去除其中长势最弱的两株幼苗。每隔2–3天用无菌蒸馏水浇灌，并在种植后10天和20天时，施用6 g/L的NPK 15-15-15水溶性肥料进行施肥。</li>
</ol>
2. 真菌
<ol>
 <li>获取一种市售制剂 球孢白僵菌 菌株GHA（Mycotrol SE，Laverlam，Cali，哥伦比亚）。 </li>
 <li>为获得单孢子储备培养物，取约一环孢子悬浮于1 ml含0.1% Triton-X 100的水溶液中，涡旋振荡10秒，然后涂布平板 100 μl 在2.5% Noble琼脂上涂布悬浮液，并在37°C下孵育24小时 25 °C将单个萌发的分生孢子转移至含有PDA的100 mm培养皿中，培养至菌丝覆盖整个培养皿（约3–4周）。</li>
 <li>在无菌条件下，用刮刀将培养基表面的真菌菌体刮下，并悬浮于10 ml无菌的0.1% Triton-X 100溶液中，涡旋振荡1分钟。随后，将悬浮液通过无菌纱布过滤，以去除菌丝，获得储备悬浮液。 </li>
 <li>使用血细胞计数板估算储备悬浮液中的分生孢子浓度。为便于计数分生孢子，制备10,000倍的系列稀释液，每次转移 100 μl 分生孢子悬液的 900 μl 加入0.1% Triton-X 100，涡旋振荡10秒，然后进行下一步稀释。 </li>
 <li>为制备接种物，将储备悬液调整至终浓度为108 分生孢子/毫升，使用公式： 
 <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="Final volume formula, equation: Stock volume x Stock concentration/10^8, analytical calculation." fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="equation 1"> </li>
 <li>为评估分生孢子活力，进行平板培养 100 μl 2.5% 营养琼脂平板上进行10,000倍稀释，于37°C培养24小时 25 °C然后，随机检查三组各100个分生孢子，以估算萌发率。当观察到分生孢子萌发出的芽管长度超过该分生孢子直径的一半时，视为已萌发。仅当平均萌发率超过90%时，方可使用该孢子悬浮液。 </li>
</ol>
3. 接种
<ol>
 <li>当植物长至第一片真叶期（约播种后14天）时进行接种。接种前24小时，用无菌蒸馏水将盆土浇透至田间持水量。</li>
 <li>采用叶面喷雾法时，使用手动喷雾器将分生孢子悬浮液（处理组）或0.1% Triton-X 100（对照组）均匀喷洒于叶片正面（上表面），直至表面饱和。用铝箔覆盖花盆顶部，防止分生孢子随液体流入土壤。喷雾后，用塑料袋覆盖植株24小时，以维持高湿度环境，促进真菌侵染。</li>
 <li>采用土壤浇灌法时，使用量筒将10 ml分生孢子悬浮液（处理组）或0.1% Triton-X 100（对照组）浇灌于植株基部的土壤表面。</li>
 <li>接种完成后，将植株放回生长室，采用随机完全区组设计进行排列。应设置不少于四个额外的实验区组，以便在同一实验中同时评估植株生长情况和内生定殖效果。</li>
</ol>
4. 评估
<ol>
 <li>以随机顺序逐个区组评估实验。对于无法在一天内完成评估的大型实验，此步骤尤为重要。</li>
 <li>处理植株前，测量并记录其从基部到顶端分生组织的高度。然后小心地将植株连根拔起，并用流动的自来水彻底清洗。</li>
 <li>从每株植株上采集两片小叶、两段根和两段茎。从小叶中随机选取样品，取自植株的第一片真叶。然后从植株中部和靠近土壤表面处各取一段3 cm长的茎样品。最后，从主根中部和根尖后方1 cm处各取一段3 cm长的主根样品。将样品分别放入三个独立的纸袋中，并做好相应标记。</li>
 <li>完成一个区组中所有植株的清洗和取样后，依次处理叶片、根部，最后处理茎部。</li>
 <li>在无菌超净工作台中对组织进行表面灭菌，操作同上文1.1步骤。将每个样品浸入无菌蒸馏水中清洗三次，然后在无菌纸巾上晾干。随后切去并弃除外缘部分，因为这些区域的内生真菌可能因接触消毒剂而被清除。</li>
 <li>将修剪后的样品切成六个小段，叶片段平均大小为6×6 mm，茎和根段各长6 mm。将六个小段接种于直径60 mm、添加了抗生素（四环素、链霉素和青霉素，各2 mg/L）的PDA培养基平板上。用封口膜密封平板，并在黑暗条件下25 °C恒温培养。每株植株产生六个平板，每个植物部位两个。</li>
 <li>处理完每个植物部位的区组后，更换漂洗用水。在丢弃使用过的漂洗水之前，取100 μl样品涂布于PDA培养基平板上，25 °C黑暗培养10天，以评估灭菌效果。若出现真菌生长，则相应样品不得用于后续分析。</li>
 <li>在20天内每隔2–3天检查一次平板，观察并记录真菌生长情况。一旦发现植物小段上出现真菌内生菌，应立即切除并转移至含有新鲜PDA培养基的新平板中，以避免原平板中相邻样品间的交叉污染。</li>
 <li>记录植物小段中B. bassiana的生长情况。Beauveria bassiana可通过其特征性的白色浓密菌丝、边缘逐渐变为乳黄色来识别。若不确定，可将样本置于一滴水中制片，在显微镜下观察是否存在该物种特有的球形分生孢子和锯齿状分生孢子梗。</li>
 <li>利用额外的实验区组评估处理对植物生物量的影响。首先测量植株从基部到顶端分生组织的高度。然后小心地将植株连根拔起，用自来水清洗干净，并在45 °C下烘干三天，以测定其干重。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

多种因素可能影响将虫生真菌确立为内生菌的实验具体结果。我们的结果表明，接种方法便是其中之一。可进行实验的生物因素包括所选作物种类或品种，以及所用虫生真菌的物种、菌株或分离物。其他可考虑调控的因素还包括接种物浓度、接种时植物的生长阶段以及植物的培养条件。
理想的接种方法应能使昆虫病原真菌在植物体内实现系统性定殖14,17,18,21。然而，实际情况似乎是接种方法往往倾向于导致局部定殖的特定模式。例如，在咖啡植株中，叶面喷雾有利于真菌在叶片中定殖，而土壤浇灌则更有利于根部定殖17。我们在普通菜豆中也发现了相同的模式。最终，接种方法的选择应根据内生真菌在植物体内的预期定殖位置来决定，该位置应与目标植食性昆虫或植物病原体所占据的生态位相匹配。
尽管培养基培养法常用于内生菌的检测与定量，但该方法可能成本较高、操作困难且易产生误差。例如，在一项优化实验中，共评估了10,800个植物组织片段（接种于1,800个培养皿上） B. bassiana 香蕉接种16其中，4,496 个切片被一种假定的微生物定植 B. bassiana，主要根据菌落形态进行鉴定。显然，对每个菌落进行显微镜下的物种验证是理想但难以实现的步骤。另一方面，有1,176个样本被其他真菌定植，因此被弃用并视为缺失数据。16然而，存在一种可能性 B. bassiana 是一种竞争力较弱或生长较慢的内生菌，如果给予足够时间，最终可能从这些区域生长出来。因此，基于培养基培养的内生菌检测方法容易产生假阳性与假阴性结果。因此，有必要开发更为可靠的检测与定量方法，例如基于聚合酶链式反应（PCR）的检测技术20,21,24是合理的。 
接种实验的最终目标应是开发出一种高效的处理方法，能够提供持久的系统性抗性，以抵御植食性生物侵害和/或病害。一个合理但尚未经过验证的假设是，内生菌定殖程度应与内生菌介导的抗性程度呈正相关。因此，在优化接种方法后，一个自然的后续步骤便是检验这一相关性。已有若干视频实验方案可帮助研究人员为特定害虫或病原体设计合适的抗性测定方法29-31。最终，正是该测定方法将决定接种方法的成功与否，以及内生菌生物防治潜力的实现程度。

虫生真菌是昆虫种群的重要调节因子，在真菌杀虫剂方面具有巨大潜力1。然而，直到最近才证实虫生真菌可作为内生真菌存在，无论是在自然条件下，还是通过多种接种方法诱导产生2。内生型虫生真菌的生态功能在很大程度上仍不清楚，但一些研究已将其与植物生长促进3,4、抗食草动物5-8以及抗病性9,10联系起来。本文所介绍方法的总体目标是将一种虫生真菌引入植物体内成为内生菌，为后续开展内生生物防治效果评估做好准备。
Beauveria bassiana（Balsamo）Vullemin（子囊菌门：肉座菌目）是研究最为深入的内生性真菌昆虫病原菌5-9,11-19，并已作为商品化真菌杀虫剂投入使用。已测试用于建立B. bassiana为内生菌的接种方法包括土壤浇灌14,17、种子包衣18和浸种14、胚根处理13,15、根部及根茎浸入11,16,18、茎部注射17、叶面喷雾14,17,20以及花部喷雾19。利用这些方法，研究人员已成功将B. bassiana引入香蕉11、菜豆7、可可13、咖啡17、玉米7、棉花7、枣椰树12、黄麻21、罂粟20、南瓜7、辐射松18、高粱14、番茄7和小麦7。近期证据表明，内生性的B. bassiana不仅有可能保护植物免受节肢动物害虫的侵害5-7,22-27，还可能抵御某些植物病原体9。
普通菜豆（Phaseolus vulgaris）是受病虫害影响最严重的作物之一，可能受到超过400种害虫和200种病原体的侵袭，这些生物的侵害被认为是全球各地区菜豆生产最主要的限制因素28。因此，普通菜豆可作为研究球孢白僵菌（B. bassiana）内生生物防治作用范围的理想模式作物。作为实现这一目标的第一步，本文描述了通过叶面喷雾和土壤浇灌两种接种方法，将球孢白僵菌（B. bassiana）引入普通菜豆体内成为内生菌的技术。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>试剂/材料名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td><td></td></tr><tr><td>Mycotrol SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>Noble 琼脂</td><td>Sigma</td><td>A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 G 钠盐</td><td>Sigma</td><td>P3032-25MU</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 (100 × 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 (60 × 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>马铃薯葡萄糖琼脂</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>普通漂白剂 (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>三元复合肥 (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM LB 显微镜</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

将真菌昆虫病原菌定殖为内生菌：迈向内生生物防治

Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

球孢白僵菌 是一种能够以内生方式定殖植物的真菌昆虫病原体。作为内生菌， B. bassiana 可能在保护植物免受食草动物取食和病害方面发挥作用。本实验方案展示了两种接种方法，用于建立 B. bassiana 内生地存在于普通菜豆（Phaseolus vulgaris），为后续内生生物防治效果的评估做准备。植物在经过表面灭菌的种子萌发后生长两周，随后接受处理 B. bassiana 10的处理8 每毫升（或每毫升水）分生孢子接种液通过叶面喷雾或土壤浇灌方式施用。两周后收获植株，采集其叶片、茎和根组织，以评估内生真菌的定殖情况。具体操作为：将样品分别进行表面灭菌，切成多个小段，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，培养20天。每隔2–3天观察植物组织片段相关的真菌生长情况，并记录发生频率 B. bassiana 以评估其内生定殖程度。接种效果的分析比较了以下情况的发生频率 B. bassiana 在特定植物部位内（即 叶片、茎或根）在不同处理组与对照组间的差异。除了接种方法外，实验的具体结果可能还取决于目标作物的物种或品种、所使用的真菌昆虫病原菌的菌株或分离物，以及植物的生长条件。

B. bassiana 能够以内生方式定殖P. vulgaris，这是对已实施的接种处理的响应（图1）。无论是叶面喷施还是土壤浇灌，均导致在超过80%的处理植株中实现了B. bassiana的内生定殖（图2）。然而，定殖程度取决于所评估的植物部位以及所采用的接种方法。叶片对喷雾接种的响应最佳；而根部仅对浇灌接种产生响应；茎部则对两种接种方法的响应相似。B. bassiana在任何对照组植物组织中均未被检测到。
无论采用何种处理，除B. bassiana外的内生菌均从15%的受试植物组织中生长出来，但在这些内生菌侵入邻近组织并影响实验结果之前，已将其从培养平板上分离移除。
接种后两周，处理组与对照组植株在外观上无法区分。两组植株的干重和株高均未检测到差异。
<img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="叶片上真菌生长的培养皿实验，显微镜下可见菌丝结构。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 枯草芽孢杆菌（Beauveria bassiana）对菜豆植株（Phaseolus vulgaris cv. Calima）内生定殖的接种处理代表性结果。 左上：无菌生长的对照平板。右上：来自植物组织片段的内生真菌污染整个平板。左下：两个植物组织片段中生长出的 B. bassiana。右下：显微镜下观察到的内生 B. bassiana 分生孢子及分生孢子梗。
<img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="植物定殖率柱状图；叶片、根、茎的比较；实验对照设置。" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 接种处理对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株GHA在菜豆（Phaseolus vulgaris cv. Calima）植株内生定殖的影响（接种后两周）。 定殖率表示定殖的植物组织段数量占培养的组织段总数的百分比。

本实验方案展示了两种接种方法，用于将虫生真菌Beauveria bassiana作为内生菌引入普通菜豆（Phaseolus vulgaris）中，为后续开展内生菌生物防治效果评估做准备。

球孢白僵菌是一种能够以内生方式定殖于植物体内的真菌性昆虫病原菌。作为内生菌，球孢白僵菌可能在……中发挥作用

大家好。我叫Ush Parsa，是国际热带农业中心SEA的一名昆虫学家。我是ViiV Artiz，也来自国际热带农业中心，这位是来自美国农业部的Fernando Vega。本视频的总体目标是演示如何促进并验证一种真菌病原体的建立过程。作为一种内生菌，在自然界中常可发现被致病性真菌感染的昆虫或螨类，而利用这类真菌病原体作为生物杀虫剂已有悠久历史。近年来，人们偶尔发现某些真菌病原体能够侵染植物，但并不表现出任何明显的存在症状。这一发现表明，它们有望作为抵御农业害虫的保护性内生菌加以利用。为了探索这种潜力，首先必须建立一种可靠的接种方法，以使真菌病原体能够在目标作物中稳定定殖为内生菌。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是研究最为深入的真菌病原体之一，且可作为商用生物农药 readily 获得。该真菌已在多种植物物种中被检测到以内生菌形式存在，包括香蕉、咖啡和肉豆蔻。最近的证据表明，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）不仅具有保护植物免受节肢动物害虫侵害的潜力，还能抵御某些植物病原体。目前对这种广谱保护作用的机制尚不完全清楚。尽管如此，在缺乏针对特定害虫或病原体遗传抗性的作物中，这一特性仍具有应用前景；而对于常同时遭受多种有害生物侵袭的作物而言，普通菜豆（Phaseolus vulgaris）便是一个典型实例。它可能受到400多种害虫和200多种病原体的影响，这些生物的侵袭被认为是全球各地区菜豆生产最主要的限制因素。因此，我们认为普通菜豆可能是研究内生菌Endo bbar保护潜力的一个理想候选作物。作为实现这一目标的第一步，Arvid展示了叶面喷施和土壤灌注作为接种方法在将Bana成功定殖为内生菌方面的有效性。将名为TOMA的菜豆种子进行表面灭菌，先将其浸入0.5%次氯酸钠溶液中2分钟，随后浸入70%乙醇中2分钟，并用无菌蒸馏水冲洗三次，以确保灭菌成功。取100微升冲洗液样品，接种于含PDA培养基的100毫米培养皿中，在25摄氏度黑暗条件下培养10天。若在这些对照样品中观察到微生物生长，则应终止实验并重新开始。将种子每三粒一组播种于直径11.5厘米的花盆中，花盆内装有经蒸汽灭菌的土壤与沙子混合物，其比例为2:1。种子萌发一周后，将植株置于25°C、相对湿度50%、光照强度9,200 lux、光周期12小时的受控条件下培养。每盆保留一株长势最强的幼苗，以保证植株健壮并消除竞争。每两到三天根据需要进行灌溉，并在种植后10天和20天施用NPK肥料，浓度为每升水含6克。为确保真菌的遗传一致性，菌株应由单孢子培养物获得。若真菌来源为患有真菌感染的昆虫，则将标本移至超净工作台，使用接种环将少量产孢的DYS真菌转移至PDA培养基上。当目标真菌在纯净培养物中生长并产孢后，可能需要将其转接到新的培养基平板上，以去除污染物。取少量培养物悬浮于1毫升含0.1% Triton X-100的水溶液中，并使用涡旋振荡器混匀。Triton X-100是一种表面活性剂，可降低水的表面张力，从而使孢子均匀分散。取100 µL该悬浮液涂布于直径100毫米的培养皿中，培养皿内含有一薄层2.5% noble agar，以便在体视显微镜下观察孢子的形态。将培养皿置于室温下避光孵育24小时，之后将单个萌发的菌丝转移至含PDA培养基的培养皿中，培养三至四周，直至菌丝完全覆盖整个培养基表面及周边。该方法可获得用于后续实验的纯真菌培养物。本演示中所用的纯培养物为来自商品化产品Microt的白僵菌（Beauveria bassiana）菌株GH HA。接种物需在无菌条件下制备。在超净工作台内，使用无菌刮铲从培养基表面刮取约一克真菌菌体，并将其悬浮于10毫升无菌的0.1% Triton X溶液中。将该悬浮液涡旋振荡一分钟，随后通过无菌纱布过滤，以分离 Candida 与 Hy-Vee。此步骤获得的悬浮液浓度需调整至每毫升含10⁸个细胞，用于后续接种。首先，通过系列稀释法估算原液浓度，以便于计数kedia。在血细胞计数板中，将100微升原液加入900微升0.1%Triton X溶液中，涡旋混匀，得到1:10的稀释液。重复此操作连续进行三次，最终获得1:10,000的稀释液。在第一稀释度中，Kedia 的数量会极多，而在最后稀释度中，其数量较少，易于计数。将 1:10,000 稀释液各 10 微升加入 Hema 细胞计数板的两个计数室中，置于显微镜下计数 Kedia。Hema 细胞计数板的刻度区域由九个大方格组成，每个大方格的容积为 100 纳升或 0.0001 毫升。为了估算样品中ED的浓度，我们计数并取计数室四个大角格中的ED平均值，再将该平均值除以0.0001。将所得浓度乘以稀释倍数10,000，即可得到原液的浓度，进而计算出原液需要调整至的最终体积。为了获得每毫升10^38个ED的接种液，我们应用以下公式。最终体积等于原液体积乘以原液浓度除以最终浓度。在我们的演示中，需要将原液调整至195.5毫升的最终体积，以达到所需浓度。在使用接种物之前，必须进行萌发试验，以评估孢子的活力。进行此实验时，取100微升1:10,000稀释的样品，加入含有2.5%高贵卵或培养基的100毫米培养皿中。使用无菌玻璃棒将样品均匀涂布于培养基表面，随后在25摄氏度黑暗条件下培养24小时。通过显微镜观察，评估长出萌发管的kedia所占百分比，以判断其活力。对于三个随机选取的100粒加拿大菌株样本，只有当平均萌发率超过90%时，该菌悬液才可用于接种。在本实验中，我们测得平均萌发率为97%。我们将演示两种接种方法：叶面喷雾法和土壤灌注法，两种方法均在植株达到第一片真叶期时进行。播种后约14天，使用手动喷雾器进行叶面喷雾，将菌悬液均匀喷洒至叶片的正面或上表面，直至叶片完全湿润。每个花盆的盆面均覆盖铝箔，以防止菌液滴落至土壤中。喷雾处理后，每株植物均用塑料袋覆盖24小时，以维持高湿度环境，促进真菌侵染。土壤灌注接种法在土壤持水量条件下进行。在将植物浇至土壤饱和后约24小时，向土壤表面施加10毫升的菌悬液。对照组植物基部以相同方式施加灭菌的0.1% Triton X。将植物放回生长室，并按照每处理三个重复的随机完全区组设计进行排列。接种后两周，我们逐个区组评估定植情况。小心收获植物，并用流动的自来水对每株植物分别进行冲洗。从植株的第一片真叶中随机选取两片小叶，并将其修剪成方形；从植株中部及靠近土壤表面处各取一段长约三厘米的茎段作为茎样品；主根样品同样取相似长度，分别从根的中部及根尖后方一厘米处获取。每个样品在无菌操作台中依次用0.5%次氯酸钠表面灭菌2分钟，再用70%乙醇处理2分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗3次，之后使其自然干燥。在无菌滤纸上，将灭菌后的样品小心解剖，去除外缘部分，因为内生菌可能因接触消毒剂而被杀灭。修剪后的样品随后被切成较小片段，叶片片段平均大小为6毫米×6毫米，茎和根片段长度约为6毫米。将菌段接种于直径60毫米、含有PDA培养基的培养皿中，培养基中添加四环素、链霉素和青霉素，每种抗生素浓度均为每升2毫克。最后用石蜡密封培养皿，并在25摄氏度黑暗条件下培养。每处理一个组织块后均需更换冲洗液，但在取100微升样品接种于直径100毫米的PDA培养皿前，需将样品在25摄氏度下培养10天，以检测消毒是否成功。如果此对照中出现任何生长现象，则丢弃该组织块，不纳入分析。在20天内每隔两到三天检查一次培养皿，观察并记录真菌生长情况。将已定殖的植物组织片段逐个切除，并分别转移至新的培养基平板上，以避免污染相邻的组织片段。球孢白僵菌的生长通过其特征性的白色浓密菌丝、菌落边缘变为乳黄色来记录。若有疑问，可在菌落定植评估当天，将样品置于载玻片水滴中，于光学显微镜下观察，检查是否存在该物种典型的球形分生孢子梗及锯齿状的梗基结构。我们还评估了处理措施对植物生长的影响。我们首先测量植株从基部到生长点顶端的株高。然后小心地将植株连根拔起，在自来水中清洗干净，并在45摄氏度下干燥三天，以测定其干重。在本次演示中，我们重复进行了两次完整的实验，以获得具有代表性的结果。两种接种方法均导致超过80%的处理植株被Bana定殖。然而，定殖程度取决于所评估的植物部位及所采用的接种方法。叶片部分的反应最佳。另一方面，喷雾接种仅对灌根接种有响应。最后，茎部对两种接种方法的响应相似。在所有受控的植物组织部分中均未检测到Bana，除了从15%被评估的植物组织部分中分离出的Bana内生菌外，但这些菌在侵入邻近组织部分并影响实验结果之前，已从培养基平板上被分离出来。接种后两周，处理组与对照组植株在外观上无明显差异，其干重和株高均未检测到显著差异。多种因素可能影响实验结果，从而确定内生病原菌是否产生最终效应。正如本视频所示，接种方法便是其中之一；可尝试的生物学因素还包括所选作物种类或品种，以及OMA病原菌的物种或菌株选择；其他可考虑调控的因素包括接种物浓度、接种时植株的生长阶段以及植株的培养条件。这些实验的最终目标应该是开发出一种高效的治疗方法，能够提供持久的系统性抗性，以抵抗内生真菌或病害。当您准备检测由内生菌介导的抗性时，我们建议您观看发表在《视觉化实验杂志》（Journal of Visualized Experiments）上的关于植物抗性机制表征的视频。请注意，内生菌在植物中非常普遍，它们很可能会影响您持续建立并检测目标真菌病原体作为内生菌的能力。希望本演示对您有所帮助。祝您的实验顺利成功。

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