番茄/ GFP-FLP / FRT方法马赛克成人的实时成像果蝇感光细胞

以下实验的总体目标是分析活果蝇视网膜中马赛克感光神经元的发育和存活。这是通过将携带 FRT 染色体上重组的突变的苍蝇库存与番茄 G-F-P-F-L-P-F-R-T 库存杂交来实现的。在后代中，嵌合克隆是在发育过程中通过有丝分裂重组产生的。

作为第二步，活苍蝇被嵌入 aeros 中，从而保持苍蝇不动。接下来，用共聚焦显微镜对固定的活果蝇的视网膜进行成像，以查看马赛克感光神经元，所有感光器都表达绿色荧光蛋白，GFP，野生型和杂合子感光细胞在合并图像上表达红色荧光蛋白番茄。纯合突变受体为绿色，而野生型和杂合光感受器为黄色。

根据同一只苍蝇在几天到几周内的可视化，获得显示光感受器神经元发育缺陷和变性的结果。番茄 G-F-P-F-L-P-F-A 方法可以帮助回答神经元变性领域的快速问题，并证明成年果蝇光感受器存活和功能对特定基因的要求。与视网膜的经典组织学切片相比，该方法还可用于解决影响发育的突变体中的 S 问题，例如 PNA 细胞极性的建立受到影响的突变体。

这种方法的第一个优点是速度快，因此可用于冰处理量筛选。这种方法的第二个优点是它是在活的果蝇中完成的，这使得可以在单个细胞水平和数周内对光感受器变性进行时间过程分析。为了通过角膜中和技术进行光感受器可视化，必须将果蝇固定在 aros 板上。

首先将喷瓶装满水，然后将其放在冰上。接下来，准备 200 毫升 1.5%aros 并将其保持在 55 摄氏度直至使用。现在，用 CO2 麻醉苍蝇至少一分钟。

将温热的 aros 溶液倒入 35 毫米或 65 毫米的培养皿中，并立即将麻醉的果蝇放入 aros 中。从每道菜 10 只苍蝇开始。通过实践学习该技术时，可以同时筛选多达 20 只苍蝇。

在解剖显微镜下，用镊子将果蝇定位在其侧面。将一个翅膀推入 aros，使翅膀和身体的一半嵌入 aros 中。将另一只翅膀粘在 aros 的表面上。

头部未嵌入。如果苍蝇嵌入得不够深，苍蝇可以自由移动头部，从而造成问题。aros 的高温可能会损坏角膜，但如果 aros 太凉爽，将很难嵌入苍蝇。

苍蝇嵌入后，将盘子转移到冰中，让 agros 凝固。一旦 aros 凝固，将培养皿放回内窥镜并调整每个头部的方向，使一只眼睛暴露在浸没物镜下。当假瞳时，黑点位于眼睛的中心，头部方向良好。

此外，去除任何遮挡眼睛的腿或 risi。定向步骤是一个关键步骤，旨在找到具有最宽视野的眼睛区域。光感受器，通常是眼睛的中心。

确定所有眼睛的方向后，用冰、冷水覆盖苍蝇，并将培养皿放在冰上以保持麻醉，直到看到苍蝇。为了可视化光感受器，首先将培养皿放在连接到显微镜载物台的载玻片上，以便可以顺利地纵培养皿在载物台上的位置。将浸没物镜浸入培养皿的水中，并将苍蝇的头部置于激发光束下方。

从 GFP 过滤器开始。如果难以区分果蝇的身体部位，尤其是腹部和头部的远端部分，那么直接观察舞台并重新定位果蝇。上下移动载物台，直到光束会聚在眼睛上。

当眼睛处于正确的水平时，它会反射激发光。通过目镜或屏幕观察眼睛的视野和角膜下方的焦点。从而可视化荧光光感受器。

为了改善共聚焦图像，请打开比通常推荐的物镜更宽的针孔。例如，对针孔的孔径使用值 2 0 4 而不是默认的 98。共聚焦显微镜为标准荧光显微镜提供了一种很好的替代技术，因为图像具有较少的背景和更宽的聚焦光感受器区域，可以跟踪同一只眼睛内单个光感受器在一段时间内的命运。

首先，将 aros 的温度降低到 45 摄氏度，以最大限度地提高动物的存活率。其次，每个盘子只放置一个果蝇，这样在观察过程中果蝇就不会混在一起。此外，请务必将苍蝇定位在同一侧，以便观察同一只眼睛。

然后在共聚焦显微镜下，通过其形状和眼睛的极性识别相同的感光器克隆。如果感兴趣的克隆在视野中放错了位置，请在水下重新定位眼睛以存储苍蝇。为了稍后再次可视化，请沥干培养皿中的水。

然后用镊子轻轻地将果蝇从 aros 中拉出，然后在组织上擦干果蝇并将其转移到小瓶中。将小瓶放回 25 摄氏度，确保苍蝇不会卡在食物中。所描述的番茄 G-F-P-F-L-P-F-R-T 方法作为光感受器克隆突变的快速筛选而实施。

筛查发现了影响各种过程和感光神经元细胞死亡的发育缺陷。结果在网上有详细的介绍。光感受器募集需要缺席的 7，特别是内部光感受器之一 R 7。

缺席时 7 个的损失导致内部光感受器和一些外部光感受器的丢失。颗粒状头部参与平面细胞极性的建立。研究发现，一些 Oma TIA 在颗粒状头部突变克隆中是倒置的，并且在 R 中需要颗粒状头部，这是正确的平面细胞极性建立所必需的，横纹肌所需的碎屑和顶膜蛋白。

发现形态发生在突变时导致不规则、更大或更小的光感受器。使用所描述的方案，使用单个光感受器的纵向追踪来跟踪它们在成年期的命运。这揭示了脂肪 P 的突变，该突变在成年后诱导进行性光感受器变性。

在嵌合花中，野生型光感受器不受影响。这种方法是可能的，因为可以通过它们所属的克隆的形态和极性来重新识别单个光感受器。为了确认脂肪 P 在脂肪 P 突变体中的作用，通过在外部光感受器中表达野生型脂肪 P 来防止感光神经元的变性。

在突变体背景下，看完这个视频，你应该对如何可视化马赛克光感受器有一个很好的了解，神经神经在生活中做一个研究神经退化和发育的事情。