创伤显微注射和分析在体内表皮的伤口本地化响应记者在果蝇胚胎。

该程序的总体目标是可视化果蝇胚胎中表皮伤口反应的体内报告基因。这是通过首先收集可以持续检测到报告基因活动的发育阶段来实现的。该程序的第二步是使用玻璃针和显微注射装置穿刺胚胎。

第三步是麻醉胚胎以可视化报告基因。最后一步是通过检测 RNA 探针的表达模式来验证报告基因定位。最终，结果可以通过共聚焦显微镜显示仅在穿刺损伤部位周围的细胞中表皮伤口反应报告基因的特异性激活。

与涉及观察伤口闭合的现有方法相比，该技术的主要优点是我们可以在活胚胎中看到由穿刺伤口触发的基因表达。这种方法可以帮助回答组织修复领域的关键问题，例如损伤周围的细胞如何调节即时伤口反应以促进修复。该技术的意义延伸到组织再生的治疗或诊断，因为伤口反应调节是第一步。

可以在任何发育阶段检测伤口愈合情况。然而，到了第 17 阶段，角质层已经太成熟了。不会激活已知的伤口报告器。

因此，为了证明，第 15 至 16 阶段将受伤以收获胚胎。收集 2 到 3 天大的成年苍蝇，50 只雌性和 25 只雄性。将它们转移到胚胎收集笼中，其中装有一盘新鲜的苹果汁、琼脂和一团酵母糊。

在接下来的三天里，每天早上将笼子放在 25 摄氏度的温度下。用新的板替换板。第三天下午，让鸡蛋在新鲜的盘子上堆积两个小时。

将此板在 14 摄氏度下存放 25 小时。产蛋 2 小时后，第二天应该会产生大约 200 个胚胎。在盘子中加入几毫升水并轻轻旋转。

然后使用画笔将水和胚胎从板转移到收集管中的尼龙网篮中。现在做一个浅漂白剂浴，将胚胎浸泡在其中两分钟。此步骤去除 CORs，即鸡蛋。

壳体将浴槽旋转几次，以防止胚胎结块。两分钟后，用流水和培养皿冲洗胚胎，每次冲洗 5 秒钟。然后将胚胎篮转移到纸巾上以擦干胚胎。

接下来，使用解剖针，将大约 50 个胚胎从网中移动到用绿色食用染料制成的琼脂平板上。染料用于增加膝部蛋的可见度。在解剖镜下，制作两排平行的胚胎，相距约 5 毫米。

行分开放置胚胎的宽度，以便进行气体交换。接下来，小心地将带有双面胶带的载玻片压在胚胎上，使行垂直于载玻片的长度。为了降低它们的内部压力，让胚胎风干。

这样他们受伤时就不会爆裂。25 分钟后，第一张准备好的玻片应干燥。现在，用两到三滴卤烃油覆盖胚胎以防止进一步脱水，并立即着手伤害干燥的胚胎。

将胚胎载玻片置于注射显微镜载物台中。在视野中找到胚胎并练习移动倒置显微镜的载物台。现在沿背腹轴聚焦在胚胎的中间平面上，并将第一排对齐的顶部胚胎带入视野。

接下来，小心地将拉出的针头放入持针器中并固定。使用微型机械手将针向下移动到载玻片上。将针与同一焦平面中的胚胎对齐。

现在，不要再调整微米机械手了。现在移动载物台，将胚胎穿刺一遍。然后移动到行中的下一个胚胎。

伤及第一排后，将针头完全向上移动并远离载物台。然后旋转载玻片并继续刺穿第二行的胚胎。一旦全部受伤，胚胎可以立即固定以进行内部杂交或抗体染色。

要检查荧光报告基因，请等待 4 到 6 小时，然后将胚胎转移到新载玻片上的新载玻片上，在胚胎周围放置玻璃珠。然后加入几滴 50%的 1 苯氧基、2 个丙醇（一种麻醉剂），并在胚胎上放置盖玻片进行显微注射。从后部向注射针上加入 1 微升化学溶液和染料，例如 0.6 摩尔过氧化氢。

允许毛细管作用将化学溶液吸入针尖。接下来，将针尖抵住碳环碳油混合物中的盖玻片边缘。首先，将安装的针头聚焦，使倾斜的盖玻片的边缘不完全成 90 度。

接下来，轻轻地将盖玻片边缘移过针尖，直到它破裂。然后对显微注射装置施加压力，并检查溶液是否从针头中流出。如果它不流，请将针头再打开一点。

现在，执行仅用于穿刺胚胎的相同程序。这一次，在穿刺的同时显微注射溶液。理想情况下，注射 10 纳升。

如果向胚胎中注射过多的溶液，Vitale 膜会在遵循文本方案中的固定程序时破裂，请特别注意以下步骤。使用玻璃移液管（而不是塑料）冲洗载玻片上的庚烷，并使用玻璃将胚胎旋转到玻璃培养皿的中心。然后，以 220 至 230 RPM 的转速在固定剂中摇动胚胎 25 分钟。

摇晃后，让界面处的气泡爆裂，然后完全去除底部的水相。另外，要小心不要拉起胚胎。加入甲醇后，受伤的胚胎稍后应聚集在界面处，像这样沿着板的表面展开胚胎，然后像这样将它们转移到双面胶带载玻片上。

然后用解剖针小心地推动胚胎，以弹出 Vitale 膜并继续脱水。用与 DOPA 脱羧酶或酪氨酸羟化酶增强子融合的荧光报告基因转化野生型果蝇，并进行所述测定。在明场下，可以看到伤口部位，而在荧光照明下，可以看到 DCD 伤口报告基因活动。

酪氨酸羟化酶报告基因显示类似的结果。两张图像均在具有 20 倍物镜的 Leica SP 双共聚焦显微镜上收集。该程序是在功能流丢失 2 突变体中执行的。

背景，DOPA 脱羧酶报告基因活性在整个表皮细胞中扩展，功能流获得在所有细胞中普遍表达的两个突变体。在整个表皮细胞中观察到报告基因的抑制。接下来，同时对胚胎进行伤口并注射溶解化合物和乌丁蓝染料过氧化氢和水在表皮细胞中扩展了 DOPA 脱羧酶报告基因活性，使用内部 U 杂交在氢氧化钠中注射甲基 B 环糊精也是如此。

伤口反应基因的转录激活是测定内源性 DOPA 脱羧酶。观察到 RNA 表达位于伤口部位周围，当然，酪氨酸羟化酶、RNA 转录本也被发现在伤口部位积累。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 60 分钟内完成。

在尝试此程序时，重要的是不要花费太多时间对齐胚胎并继续进行该程序的后续步骤。