在3D揭示侵入性癌症细胞骨架组织

以下实验的总体目标是观察癌细胞的形态及其在 3D 培养物中与细胞外基质的相互作用，这首先通过标记大鼠尾部胶原蛋白来实现，其中一种带有红色荧光 DTRA 以允许 3D 胶原蛋白网络可视化。在第二步中，以单细胞或多细胞类固醇形式生长的癌细胞被嵌入 3D Tamra 标记的胶原蛋白基质中。然后让细胞分散到整个胶原蛋白中一到三天，模拟癌细胞在体内侵袭和迁移到周围的三个 DS 基质中。

接下来，对细胞进行固定，并使用适当的抗体和 Phin 进行免疫染色，以观察目标蛋白质的细胞形态和定位。最终，可以通过共聚焦显微镜采集样品的深 Zacks 来分析 3D 培养的癌细胞的独特形态及其与 3D 细胞外基质的相互作用。这种方法有助于更好地描述 3D 环境中细胞成分的分子组成、功能和定位，从而帮助回答细胞迁移领域中的关键问题，这些环境多年来一直在 2D 环境中进行分析。

与我一起演示此程序的是我们实验室的技术人员 Anton Smo，用 Tamara 标记胶原蛋白 1。首先，在一毫升一次性注射器中缓慢填充一毫升高浓度大鼠尾胶原蛋白，一种避免气泡的溶液。连接一根 21 号皮下注射针头，然后将胶原蛋白注射到预先浸泡的 3 毫升透析盒中，截止值为 10， 000 道尔顿蛋白质分子量，注意不要用针头损坏膜。

拉回柱塞以去除凝胶盒中的所有空气，然后用 1 升标记缓冲液透析胶原蛋白过夜。第二天早上，小心地从透析盒中取出胶原蛋白，然后在 2 毫升微量离心管中将 1 毫升透析的胶原蛋白溶液与 1 毫升新鲜稀释的冷 Tamra 溶液混合。用箔纸包裹试管，旋转孵育过夜。

第二天早上，将 TAMRA 标记的胶原蛋白转移到预先浸泡的透析盒中，并用 1 升标记缓冲液透析胶原蛋白过夜，以去除多余的染料。然后，为了保存 Tamara 标记的胶原蛋白，将透析盒放入一升每体积 0.2% 的乙酸溶液中，pH 值为 4，并将透析盒透析过夜。同样，第二天早上，使用微量移液器将 Tamara 标记的胶原蛋白从透析盒转移到微量离心管中，测量胶原蛋白的最终体积，然后计算 Tamara 标记的胶原蛋白的最终浓度。

考虑到所用胶原蛋白溶液的初始体积和浓度，并将 DY 胶原蛋白储存在 4 摄氏度，避光以包埋单细胞。确定每毫升 2 毫克的体积。Tamara胶原蛋白混合物进行实验所必需的，然后混合适当体积的10 XPBS和一种正常氢氧化钠。

然后以 1 比 6 的比例混合适当体积的 Tamara 标记胶原蛋白和未标记胶原蛋白，以达到每毫升 2 毫克的最终总胶原蛋白浓度。现在将目标细胞悬浮在适当体积的不含 FBS 的冷藏细胞培养基中，然后将细胞添加到 Terah 胶原蛋白混合物中，以获得每毫升 10 倍至第 5 个细胞的最终细胞密度。通过在 pH 试纸上测试 10 微升混合物来确认 pH 值，然后将 100 微升 Tamara 胶原蛋白细胞悬液滴到玻璃底培养皿上，让混合物在室温下聚合，直到胶原蛋白在约 30 至 45 分钟后变成白色凝胶。

然后小心地添加足够的培养基以覆盖胶原包埋的细胞液滴，并将液滴保持在 37 摄氏度的 10% 二氧化碳中，以留出足够的时间让细胞在整个基质中迁移。通常 1 到 3 天用于包埋细胞类固醇。移液 100 微升新鲜稀释的三方胶原蛋白。

混匀到玻璃底培养皿上，让胶原蛋白开始聚合 2 到 5 分钟，以略微增加凝胶粘度。然后收集细胞类固醇并将其放在新鲜的培养皿上。去除任何多余的液体，并将类固醇重悬于 10 微升 Tamara 胶原蛋白混合物中，以防止细胞培养基中的胶原蛋白稀释。

然后使用 P 20 移液器收集胶原蛋白悬浮类固醇，并将其置于 100 微升 TEMA 胶原蛋白混合物滴剂顶部的中心。让胶原蛋白短暂聚合 2 到 5 分钟通常足以确保您的 OID 距离胶原蛋白滴剂的顶部和底部超过 100 微米。但是，如果您的类固醇仍然下沉，请尝试将培养皿倒置约两分钟，然后将其旋转到直立位置。

如前所述，让胶原蛋白聚合，然后小心地添加足够的培养基以覆盖胶原蛋白类固醇滴剂。然后孵育液滴，让细胞在整个基质中迁移以进行免疫荧光染色。首先小心地去除细胞培养基并用 PBS 冲洗类固醇包埋的胶原蛋白基质。

接下来，用提取固定缓冲液孵育细胞。再过 5 分钟后，用 PFA 和蔗糖在 PBS 中固定细胞 30 分钟。然后冲洗细胞。

现在将细胞与在 PBS 中稀释的目标一抗一起孵育。然后洗涤基质 3 次，每次 30 分钟。第三次洗涤后，将基质与二抗、Alexa 偶联的 Phin 和在 PBS 中稀释的 DPI 一起孵育。

然后再次清洗基质后，去除多余的液体，并加入约 500 微升的封固剂，填充培养皿底部。现在用 24 毫米的盖玻片密封每一滴，小心不要压在液滴上并损坏基质的结构。对样本进行成像。

将 40 倍物镜置于胶原蛋白滴剂的中间。然后使用荧光灯，获得 XY 和 xz axi 中样品的概览。接下来，切换到共聚焦实时成像模式。

使用 561 纳米激光器，从玻璃底部开始聚焦，直到胶原纤维开始出现。考虑一下这个深度 Z 等于零微米。现在提高物镜，直到达到 Z 等于零以上的 100 微米，然后对在 z 等于 100 微米或以上发现的细胞进行成像，以避免刚性玻璃底部标记大鼠尾部胶原蛋白的任何张力效应，用 Tamara 标记小鼠尾胶原蛋白一，可以轻松制备和可视化 3D 胶原蛋白网络。

缓慢的室温聚合允许形成这些网络，此处以红色显示，其组织与体内发现的细胞骨架蛋白（如微管蛋白，此处显示为蓝色或肌动蛋白）相似，可以通过免疫染色可视化，如在 3D 矩阵中查看时这些图像所示， 结肠腺癌 CT 26 细胞呈现典型的间充质形态，其特征是细长的细胞体尖端有富含 F 肌动蛋白的细胞突起，类似于 Filip Podia 和 lam podia。这种细长的形态在试图通过侵入胶原蛋白基质来逃避细胞类固醇的细胞中更为明显。培养两天后，细胞开始侵入胶原蛋白 3D 基质，远离细胞类固醇。

从所有视图平面分析收集的 Z 堆栈以确保这些图像中细胞的均匀 3D 分布至关重要。例如，当可视化为最大 XY 投影时，以类固醇形式生长的 CT 26 细胞似乎广泛侵入 3D 胶原蛋白基质。然而，x XZ 视图显示，与类固醇体积相比，细胞实际上侵入了受限的 Z 间期，这表明侵袭区域优先。

这种具有代表性的类固醇实际上被放置在离培养皿的玻璃底部太近的地方，导致细胞从类固醇中迁移出来，不是通过侵入 3D 胶原蛋白基质，而是通过在 2D 刚性玻璃上爬行遵循此程序。其他方法，如嵌入 TAMRA 胶原基质中的表达 GFP 的细胞的实时成像，可用于密切跟踪细胞与基质之间的动态相互作用或细胞诱导的基质变形。