分离，培养和成像胎儿胰腺细胞集群
2014年5月18日
一个协议隔离开来，从人胎儿胰腺细胞衍生的文化，形象胰岛细胞团（IC卡）中说明。该方法的详细信息需要从组织，文化为单层或悬浮液中的聚集和图像增殖的标记和胰腺细胞命运的决定产生IC卡的步骤。
该程序的总体目标是分离人胎儿胰腺细胞簇。这是通过首先清洁和粗切胰腺来实现的。接下来，胰腺组织用胶原酶消化。
然后将消化的聚集体重悬并接种在培养皿中。最后，将细胞接种在 HTB 9 基质上或作为聚集体孵育，并进行实验。最终，R-T-P-C-R.
Western Blood Analysis 或免疫荧光显微镜检查用于显示基因或蛋白质表达或定位的变化。该技术的意义延伸到 1 型糖尿病的治疗，因为在体外调节人胰腺前体细胞转变为成熟葡萄糖反应性胰岛素分泌细胞的许多关键生化过程仍然未知。一般来说，刚接触这种方法的人会因为消化不完全或过度消化而感到困难，从而导致胎儿胰腺细胞簇形成不良。
演示此程序的是我实验室的技术人员 Lopez 开始解剖胎儿胰腺，抽吸液体，然后用没有 HBSS 的镊子将胰腺转移到 60 毫米的培养皿中，并去除任何可见的脾脂肪或结缔组织。使用大约半毫升 HBSS 冲洗胰腺，然后使用镊子将其转移到一个小的无菌坩埚和冰桶中。将坩埚放入 50 毫升离心管的支架中，用两把剪刀将剪刀的一侧保持在固定位置，仅移动相反的手柄，同时将剪刀的尖端放在坩埚底部，在 1.5 毫升胶原酶和切碎的胰腺中放入含有制备的胶原酶的小瓶中，用两把剪刀大力切开胰腺几分钟。
根据文本方案，置于设置为 37 摄氏度、200 RPM 的水浴摇床中长达 10 分钟。在最初的 5 分钟内，不要检查超过一次。消化时间取决于组织质量，只需 6 分钟就足够了。
终点是颗粒小而均匀的时候。停止胶原酶活性。使用冷的 HBSS 填充样品瓶，然后放在冰上，让团块沉淀 10 分钟。
孵育后，从顶层吸出，使其略低于半满。如果由于细胞死亡而存在 DNA 串，则以 100 μL 或 10 mL/mL 的速度将 DNA 加入溶液中，然后将细胞转移到 15 mL 锥形管中，并加入 5 mL HBSS 离心机，以 300 gs 离心 5 分钟。吸出 HBSS 后，将细胞重悬于 5 毫升含有 RPMI 1640 谷氨酸、10% 正常人血清、10 毫摩尔堆、pH 7.2、青霉素链霉素和真菌区的培养基中。
然后将细胞接种在 60 毫米培养皿中，并在 37 摄氏度下悬浮孵育细胞 72 小时，以聚集并形成 ICCS。孵育板后，如前所述，人细胞系 HTB 9 基质上的细胞每 48 小时更换一次生长培养基，以对贴壁细胞进行免疫荧光。我们去除培养基并用 PBS 洗涤细胞。
用 10 ml PBS 洗涤细胞一次后，加入 4% PFA 在室温下固定细胞 20 分钟，然后使用 PBS 洗涤细胞两次。接下来，在室温下用 0.2%tritton X 100 的 PBS 溶液孵育细胞 10 分钟并用 PBS 洗涤细胞两次后，将细胞在封闭缓冲液中孵育 1 小时，将 60 μL 一抗溶液移液到已放入可密封容器中的 perfil 上。然后从 12 孔板中取出盖玻片，吸干额外的封闭缓冲液，然后将其放在一抗滴剂的顶部。
将样品在室温下孵育 90 分钟。洗涤样品 3 次后，将一滴荧光二抗滴在含有 PBS 的多联体上。冲洗样品并用纸巾吸干多余的 PBS，然后将其滴在抗体溶液滴上。
像以前一样清洗样品和印迹后，将样品避光并在室温下孵育 1 小时，加入一滴安装凝胶并将盖玻片倒置到载玻片上。使用抽吸去除任何多余的封固剂，并使用 200 μL 移液器吸头的背面轻轻敲出任何气泡。让样品干燥 20 分钟，然后在荧光或共聚焦显微镜下检查。
仔细准备胎儿 ICC 对于本视频中描述的方案的成功至关重要。这一系列的面板说明了细胞在电镀后通常如何看待定义的时期。例如，纯化后，新铺板的细胞聚集体显示为小而稀疏的透明簇，包含很少的细胞。
最初 24 小时后，许多细胞簇变大，到 48 小时仍有许多小簇。簇显著扩大，但在 72 小时时仍保持不对称。ICCS 应该是透明的，大小和形状相对均匀，并且可以接种在基质上，也可以在有或没有化学品或药物的情况下再生长 72 小时以产生胰腺内分泌细胞。
这些数字显示了许多常用的抗体，用于评估 ICC 增殖或向胰腺内胚层分化。在这里，ICCS 接种在 HTV 9 上，生长 4 天，并对胰腺发育的关键标志物 PDX one 进行染色。虽然我们常规进行 ICC 的体外染色，但更常见的是人类胎儿 ICC 被移植到裸鼠的肾包膜下，并允许在体内增殖和分化。
在这个例子中，含有移植 ICC 的石蜡包埋的肾切片用上皮细胞标志物细胞角蛋白（绿色）和KI 67（红色）染色，以评估细胞增殖。在另一个例子中，在裸鼠的肾包膜下移植和成熟后，检测到绿色的人胰岛素和红色胰高血糖素。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 90 分钟内完成。
在尝试此程序时，重要的是要记住每批胶原酶都不同，需要根据经验进行优化。看完这个视频，你应该对如何隔离文化和形象有了很好的了解。人胎儿胰腺细胞簇。
概览
本文介绍了一种详细的协议，用于分离、培养和成像源自人类胎儿胰腺细胞的胰岛细胞簇（ICCs）。该方法包括从胰腺组织生成ICCs、培养它们，以及评估与细胞增殖和分化相关的标记物的步骤。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 内分泌学
背景
- 了解胰腺细胞的发育对于糖尿病研究至关重要。
- 人类胎儿胰腺细胞可以提供关于胰岛素分泌细胞成熟的见解。
- 该协议旨在提高分离和培养这些细胞的效率。
- 挑战包括在分离过程中防止不完全或过度消化。
研究目的
- 分离人类胎儿胰腺细胞簇用于研究。
- 增强对胰腺细胞命运决定的理解。
- 促进1型糖尿病潜在治疗的研究。
使用的方法
- 使用胶原酶进行胎儿胰腺组织的解剖和消化。
- 将消化的细胞在培养皿中重新悬浮和接种。
- 使用免疫荧光显微镜分析基因和蛋白表达。
- 评估ICC随时间的形态和增殖。
主要结果
- 成功生成表现出随时间明显形态变化的ICCs。
- 识别了胰腺发育的关键标记物。
- 展示了ICCs体内移植的潜力。
- 提供了关于胰腺前体细胞分化为功能性胰岛素分泌细胞的见解。
结论
- 该协议为分离和培养ICCs提供了一种可靠的方法。
- 需要进一步研究来探索这些细胞的治疗潜力。
- 了解胰腺细胞的成熟过程可以为糖尿病治疗策略提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation and culture of human fetal pancreatic cell clusters enable mechanistic de-risking of endocrine differentiation pathways relevant to Type 1 diabetes therapeutic development. The protocol supports target validation by providing a reproducible system to assess pancreatic precursor maturation and hormone expression. This enhances predictive confidence in early discovery by linking in vitro models to in vivo functional outcomes such as C-peptide release post-transplantation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional and translational regulators of pancreatic endoderm commitment using markers like PDX1.
- Operational Value: Provides a standardized isolation workflow from fetal pancreatic tissue using collagenase digestion and density-based separation.
- Scientific Value: Supports functional validation of insulin-producing capacity through glucose-stimulated C-peptide release in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates adherent or suspension cultures suitable for high-content imaging of proliferation (e.g., KI67) and hormone co-expression (insulin/glucagon).
- Operational Value: Enables assay standardization through defined culture conditions (RPMI 1640, 10% normal human serum, HEPES) and fixed timepoints for analysis.
- Scientific Value: Facilitates biomarker alignment by detecting pancreatic lineage markers via immunofluorescence or Western blot.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges in vitro differentiation studies with in vivo validation under the kidney capsule of nude mice.
- Operational Value: Supports longitudinal assessment of engraftment, proliferation, and hormone production over time.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by comparing ICC-derived outcomes to fresh tissue transplants.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, supporting iterative design-build-test cycles for diabetes-relevant cell therapies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of transcription factors and signaling pathways governing endocrine precursor maturation.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts for proliferation and differentiation under controlled culture conditions.
- Analytics: Supports comparative analysis of gene/protein expression via RT-PCR, Western blot, or immunofluorescence to evaluate experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro ICC maturation to in vivo functionality, enabling preclinical continuity for therapeutic candidates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation and culture platform applicable across fetal pancreatic studies and comparative stem cell models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in pancreatic differentiation by linking marker expression to hormone output.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized digestion timing, plating density, and media formulation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional validation data prior to resource-intensive preclinical programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on in vitro-to-in vivo translational concordance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection and enzymatic optimization to avoid incomplete or over-digestion of fetal pancreatic tissue.
- Dependent on access to purified collagenase and sterile culture infrastructure for suspension and adherent culture.
- Necessitates standardized fixation, permeabilization, and blocking protocols for consistent immunofluorescence results.
- Requires adaptation of culture duration and matrix coating (e.g., HTB9) based on experimental goals for proliferation vs. differentiation.
- Limited by donor variability in fetal pancreatic tissue quality and gestational age, necessitating batch-wise optimization.
