Name: 通过家庭照顾者收集唾液并测量虚弱社区居住老年人的唾液皮质醇和 α-淀粉酶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-18T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学习通过家庭照顾者收集唾液并测量唾液皮质醇和α-淀粉酶的方法，用于研究虚弱社区居住老年人的压力反应。该方案为生物行为学研究提供了可行的居家采样流程。

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由NINR资助，项目编号K23NR012017-01A1 阿尔茨海默病中的肾上腺皮质反应与神经精神症状

1. 招募
<ol>
	<li>获得机构审查委员会对采集方案的批准，特别注意对认知能力受损受试者的知情同意以及生物样本的采集9-10。</li>
	<li>通过评估口腔健康状况（即 &#34;过去两天内您是否注意到牙龈出血？&#160;&#34;）排除可能有血液渗入唾液的参与者11。</li>
</ol>
2. 唾液采集用品的准备
<ol>
	<li>在安排对已签署知情同意书的参与者进行家庭访问之前，收集并准备好必要的用品：4 支 Salimetrics 儿童采样棉签（SCS）、4 个棉签储存管、4 个彩色编码管帽、5 张白色标签、1 个塑料自封袋、唾液采集说明单、5 副丁腈手套以及储存盒。</li>
	<li>戴上丁腈手套。用戴着手套的手将 4 支 SCS 分别放入 4 个储存管中，并依次盖上黄色、橙色、紫色和蓝色的彩色管帽。</li>
	<li>在储存管上贴上标签，标明采集时间（ awakening 时—黄色帽，awakening 后 30 分钟—橙色帽，中午午餐前—蓝色帽，晚餐前—紫色帽）。</li>
	<li>将 4 个已加盖的储存管、唾液采集说明单和 4 副丁腈手套放入自封袋中，并在袋子上贴上受试者编号和采集日期的标签。</li>
	<li>安排一次简短的家庭访问，对象为先前已签署知情同意书的受试者，访问时间为唾液采样前一天。到达受试者家中后，提供装有上述用品的塑料袋及采集说明单。</li>
</ol>
3. 唾液采集说明
<ol>
	<li>查阅说明表（示例见图 1）。强调需记录唾液采集的开始和结束时间。</li>
	<li>记录参与者在过去48小时内使用的所有处方药和非处方药的名称、剂量及用药时间表12。</li>
	<li>指导参与者将头部前倾，使唾液积聚于口腔底部。</li>
	<li>指导唾液采集人员（SC）在惯用手戴上丁腈手套（仅在手持棉签时需要）9。</li>
	<li>指导SC打开棉签储存管盖以取出口腔棉签。切勿将管内的篮状插件取出。</li>
	<li>指导SC将口腔棉签置于老年人舌前下方，吸收约3滴（75 µl）积聚的唾液，并将棉签保持原位2分钟，以确保充分饱和。棉签饱和后会变为不透明状。</li>
	<li>让SC将已饱和的口腔棉签放回储存管的篮状插件中，并重新盖上管盖。</li>
	<li>让SC立即将管子放入储存盒并置于冰箱冷冻保存。将手套丢弃至垃圾桶中。</li>
	<li>让SC在唾液采集说明表上记录开始和结束时间。</li>
</ol>
4. 提供额外说明并回答问题
<ol>
	<li>指导SC（研究协调员）告知受试者，次日需在四个时间点采集唾液样本，分别为醒来时、醒来后30分钟、上午中段和傍晚13,14。</li>
	<li>指导SC（研究协调员）避免在主要进餐后1小时内采集样本。</li>
	<li>要求SC（研究协调员）指导受试者在唾液采集前10分钟用清水漱口。</li>
	<li>若唾液样本明显被血液污染，则应弃用该样本。</li>
	<li>指导SC（研究协调员）将唾液样本保存在冷冻环境中，直至研究团队取回。确认研究团队将安排具体时间和日期取回冷冻样本，并为后续采集日提供新的唾液采集用品。</li>
</ol>
5. 唾液的处理与加工
<ol>
	<li>样本从受试者冰箱取出后，需使用保温冰袋在运输过程中保持冷冻状态。</li>
	<li>到达实验室后，将试管上的白色标签更换为连续条形码。</li>
	<li>确认连续条形码与受试者编号、采集日期及采集时间一致。</li>
	<li>将唾液样本放回冷冻箱（-20 °C）以沉淀黏蛋白。</li>
</ol>
6. 可选：唾液皮质醇检测方案
<ol>
	<li>确保所有唾液检测试剂盒的试剂均达到室温。</li>
	<li>唾液样本解冻后，涡旋振荡并以 1,500 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>按照试剂盒说明书配制洗涤缓冲液。</li>
	<li>用移液器将 25 µl&#160;标准品和对照品加入板孔的相应位置。标准品和样本应设复孔。</li>
	<li>向各孔中加入 200 µl&#160;酶结合物。</li>
	<li>将酶标板置于摇床上，500 rpm 混匀 5 分钟（随后在室温孵育 55 分钟）。</li>
	<li>用洗涤缓冲液洗涤酶标板 4 次，并吸干。</li>
	<li>每孔加入 200 µl&#160;四甲基联苯胺（TMB）溶液。</li>
	<li>再次将酶标板置于摇床上，500 rpm 混匀 5 分钟，然后避光孵育 25 分钟。</li>
	<li>每孔加入 50 µl&#160;终止液，并以 500 rpm 混匀 3 分钟。</li>
	<li>加入终止液后 10 分钟内擦净酶标板底部，在酶标仪上于 450 nm 波长处读取吸光度。</li>
	<li>使用平均光密度值计算皮质醇浓度。从零孔、标准品孔、对照品孔和样本孔的平均光密度中减去非特异性结合孔的平均光密度。</li>
	<li>使用具备逻辑拟合功能的软件估算对照品和未知样本的浓度。</li>
</ol>
7. 可选：唾液α-淀粉酶活性测定实验方案
<ol>
	<li>将酶标仪设置为在 37 °C 下孵育，并以中心测量动力学模式分别在 1 分钟和 2 分钟时读数。</li>
	<li>使用 405 nm 滤光片，不使用参比滤光片。</li>
	<li>用提供的α-淀粉酶稀释液稀释唾液样本。</li>
	<li>通过以下步骤制备 1:200 稀释液：首先用移液器将 10 µl&#160;唾液加入 90 µl&#160;α-淀粉酶稀释液中，制备 1:10 稀释液；然后取 10 µl&#160;该 1:10 稀释液加入 190 µl&#160;α-淀粉酶稀释液中进一步稀释（得到 1:20 稀释液）。</li>
	<li>使用预热的微孔板孵育器将α-淀粉酶底物溶液加热至 37 °C。</li>
	<li>向各孔中加入 8 µl&#160;稀释后的唾液样本。</li>
	<li>同时加入 320 µl&#160;预热（37 °C）的α-淀粉酶底物溶液。</li>
	<li>在 37 °C 酶标仪中进行动力学读数时，立即将微孔板放入酶标仪并启动读数程序。</li>
	<li>用 3 分钟时的读数减去 1 分钟时的读数，再乘以转换因子。</li>
	<li>按以下公式计算淀粉酶活性：ΔAbs./min × TV × DF / MMA × SV × LP = U/ml。其中，ΔAbs./min 表示每分钟吸光度变化；TV 为总反应体积（0.328 ml）；DF 为稀释倍数；MMA 为 2-氯-对硝基苯酚的毫摩尔吸光系数（12.9）；SV 为样本体积（0.008 ml）；LP 为光程（0.97，为试剂盒所附微孔板的特定值）。</li>
</ol>

<ol><li>Granger, D. A., Fortunato, C. F., Beltzer, E. K., Virag, M., Bright, M. A., Out, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus+on+methodology%3A+Salivary+bioscience+and+research+on+adolescence%3A+An+integrated+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Adolescence%22%5BJournal%5D)">Focus on methodology: Salivary bioscience and research on adolescence: An integrated perspective.</a> Journal of Adolescence. 3 (10), 1081-1095 (2012).</li>
<li>Savla, J. T., Granger, D. A., Roberto, K. A., Davey, A., Blieszner, R., Gwazdauskas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortisol+and+alpha+amylase+reactivity+to+care-related+stressors+in+spouses+of+persons+with+mild+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Psychology+and+Aging%22%5BJournal%5D)">Cortisol and alpha amylase reactivity to care-related stressors in spouses of persons with mild cognitive impairment.</a> Psychology and Aging. , (2013).</li>
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<li>Woods, D. L., Kim, H., Yefimova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morning+cortisol+in+relation+to+behavioral+symptoms+of+nursing+home+residents+with+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reseach+in+Nursing%22%5BJournal%5D)">Morning cortisol in relation to behavioral symptoms of nursing home residents with dementia.</a> Biological Reseach in Nursing. (2), 13-132 (2011).</li>
<li>Granger, D. A., Johnson, S. B. Salivary Biomarkers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGranger%2C+DA+%22Encyclopedia+of+Behavioral+Medicine%22">Encyclopedia of Behavioral Medicine</a>. Gellman, M. D., Turner, J. R. , Springer. New York. 1005-1009 (2012).</li>
<li>Nater, U. M., Rohleder, N., Schlotz, W., Ehlert, U., Kirschbaum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+the+diurnal+course+of+salivary+alpha-amylase%29%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Determinants of the diurnal course of salivary alpha-amylase).</a> Psychoneuroendocrinology. 32, 392-401 (2007).</li>
<li>Navazech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+collecting+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+NY+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Methods for collecting saliva.</a> Annals of the NY Academy of Sciences. 694, 72-77 (1993).</li>
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<li>Kivlighan, K. T., Granger, D. A., Schwartz, E. B., Nelson, V., Curran, M., Shirtcliff, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+blood+leakage+into+the+oral+mucosa+and+its+effects+on+the+measurement+of+cortisol%2C+dehydroepiandrosterone%2C+and+testosterone+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Quantifying blood leakage into the oral mucosa and its effects on the measurement of cortisol, dehydroepiandrosterone, and testosterone in saliva.</a> Hormones and Behavior. 46, 39-46 (2004).</li>
<li>Granger, D. A., Hibel, L. C., Fortunato, C. K., Kapelewski, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medication+effects+on+salivary+cortisol%3A+Tactics+and+strategy+to+minimize+impact+in+behavioral+and+developmental+science%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Medication effects on salivary cortisol: Tactics and strategy to minimize impact in behavioral and developmental science.</a> Psychoneuroendocrinology. 34, 1437-1448 (2009).</li>
<li>Nater, U. M., Rohleder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+alpha-amylase+as+a+noninvasive+biomarker+for+the+sympathetic+nervous+system%3A+Current+state+of+research%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Salivary alpha-amylase as a noninvasive biomarker for the sympathetic nervous system: Current state of research.</a> Psychoneuroendocrinology. 34 (4), 486-496 (2009).</li>
<li>Hellhammer, J., Fries, E., Schweisthal, O. W., Scholtz, W., Stone, A. A., Hagemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Several+measurements+are+necessary+to+reliably+assess+the+cortisol+rise+after+awakening%3A+State-+and+trait-components%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Several measurements are necessary to reliably assess the cortisol rise after awakening: State- and trait-components.</a> Psychoneuroendocrinology. 32, 80-86 (2007).</li>
<li>Pruessner, J., Kirschbaum, C., Meinlschmid, G., Hellhammer, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+formulas+for+computation+of+the+area+under+the+curve+represent+measures+of+total+hormone+concentration+versus+time-dependent+change%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Two formulas for computation of the area under the curve represent measures of total hormone concentration versus time-dependent change.</a> Psychoneuroendocrinology. 28, 916-931 (2003).</li>
<li>Twisk, J. W. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTwisk%2C+JWR+%22Applied+multilevel+analysis%3A+A+practical+guide%22">Applied multilevel analysis: A practical guide</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2006).</li>
<li>Hox, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHox%2C+JJ+%22Multilevel+analysis%3A+Techniques+and+applications%22">Multilevel analysis: Techniques and applications</a>. , Erlbaum. Mahwah, NJ. (2002).</li>
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<li>Donzella, B., Talge, N. M., Smith, T. L., Gunnar, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+spear+or+not+to+spear%3A+Comparison+of+saliva+collection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Psychobiology%22%5BJournal%5D)">To spear or not to spear: Comparison of saliva collection methods.</a> Developmental Psychobiology. 50 (7), 714-717 (2007).</li>
<li>Beltzer, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+flow+and+alpha-amylase%3A+Collection+technique%2C+duration%2C+and+oral+fluid+type%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Salivary flow and alpha-amylase: Collection technique, duration, and oral fluid type.</a> Physiology and Behavior. 101 (2), 289-296 (2010).</li>
<li>Granger, D. A., Johnson, S. B., Szanton, S. L., Out, D., Schumann, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+salivary+biomarkers+into+nursing+research%3A+an+overview+and+review+of+best+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research+in+Nursing%22%5BJournal%5D)">Incorporating salivary biomarkers into nursing research: an overview and review of best practices.</a> Biological Research in Nursing. 14 (4), 347-356 (2012).</li>
<li>Shultheiss, O. C., Stanton, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShultheiss%2C+OC+%22Assessment+of+salivary+hormones.+Methods+in+Social+Neuroscience%22">Assessment of salivary hormones. Methods in Social Neuroscience</a>. Harmon-Jones, E., Beer, J. S. , Guilford Press. New York. 17-44 (2009).</li>
</ol>

为了充分披露利益关系，DAG 是 Salimetrics LLC（宾夕法尼亚州州学院）和 SalivaBio LLC（马里兰州巴尔的摩）的创始人，并担任首席科学与战略顾问。这些关系由约翰斯·霍普金斯大学医学院利益冲突委员会以及亚利桑那州立大学研究合规与诚信办公室的政策进行管理。

为了增进对老年衰弱个体在生物学敏感性和易感性方面个体差异的理解，研究人员需要让照护者参与生物样本的采集。这些采集方案应尽可能无创、易于操作，并能获得高质量的样本。由于主要挑战之一是确保照护者在正确的时间点进行采样，因此应筛选被指定为唾液采集者的家庭照护者，评估其理解8步唾液采集流程的书面和口头说明的能力。
在研究生物敏感性和易感性与日常生活背景的关系时，本研究获得的知识可能最具参考价值。本文所述方案适用于脆弱且代表性不足的社区样本。研究结果表明，经过 minimal 培训后，体弱老年人的照护者能够高效地多次采集高质量的唾液样本。由于照护者操作失误导致的样本采集遗漏极少，大多数采集样本的体积足以满足检测要求，且检测结果显示唾液皮质醇和α-淀粉酶具有预期的昼夜节律变化模式。
然而，我们的经验表明，在这些高风险社区样本中采集唾液时，必须采取若干步骤，以提高依从性，减轻参与者及照护者的负担，并减少失访和数据缺失。我们为下一代研究提出以下具体建议。必须让唾液采集者了解数据收集工作的重要性，以及他们对科学研究和知识积累所作的贡献。在本方案...

指导生命全程发展科学的理论视角强调，有必要将生物、行为、社会和情境因素整合到对健康与行为的研究中1。当代理论模型主张，个体在生物敏感性及对情境因素易感性方面的差异可能调节风险与韧性的平衡，并可预测脆弱人群的发病率和死亡率。大量研究关注生命早期发展阶段的这些问题1，但直到最近，研究者才得以在患有医学和认知功能衰弱的老年群体中检验这些核心理论观点2-4。推动这一趋势的原因之一，是已开发出通过口腔液体（唾液）无创测量个体内部及个体之间神经生物学活动差异的技术，包括下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴和自主神经系统（ANS）的活动5,6。
唾液检测可用于收集纵向常模数据，以比较不同治疗组之间的变化、评估干预措施的有效性，或进一步扩展至测量多个个体间的共调节或活动情况。这些检测所获得的数据有助于揭示与老年人群常见健康问题（如癌症、心脏病或神经认知障碍）相关的应激性生物学过程7。由于唾液样本采集被认为易于掌握、成本低廉、侵入性极小且可接受度高，唾液作为生物样本正受到越来越多的关注8。然而，传统的采集方法要求参与者通过吸管将唾液滴入小试管中，这对年老体弱的受试者而言往往过于复杂或难以接受。因此，亟需开发新的方法，以标准化采集与处理的分析前阶段，从而获得最准确且有意义的结果。唾液生物科学领域正在迅速发展，本展示的目的在于为有意将这些测量方法整合到衰老研究中的科研人员提供最新进展更新和实用的操作指南。在本方案中，我们演示了（1）由家庭照护者在家庭环境中对认知功能受损的老年人进行唾液样本采集的操作流程，（2）通过唾液皮质醇和唾液α-淀粉酶（sAA）测量下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴和自主神经系统（ANS）活动的操作流程，以及（3）唾液皮质醇和sAA数据中典型的个体差异。

<table><tbody><tr><td>Salimetrics 儿童采样拭子（SCS）</td><td>Salimetrics</td><td>5001.06</td><td>室温保存，每包 50 支</td></tr><tr><td>拭子储存管（2 ml）</td><td>Sarstedt</td><td>51.1534.004</td><td>每包 100 支</td></tr><tr><td>条形码标签</td><td>CISBR</td><td>n/a</td><td>请联系 CISBR 订购</td></tr><tr><td>彩色编码聚丙烯小瓶盖（用于 SST）</td><td>Sarstedt</td><td>（见下文）</td><td></td></tr><tr><td>白色</td><td>Sarstedt</td><td>65.793.517</td><td>每包 1,000 个</td></tr><tr><td>蓝色</td><td>Sarstedt</td><td>65.793.513</td><td>每包 1,000 个</td></tr><tr><td>黄色</td><td>Sarstedt</td><td>65.793.514</td><td>每包 1,000 个</td></tr><tr><td>绿色</td><td>Sarstedt</td><td>65.793.515</td><td>每包 1,000 个</td></tr><tr><td>橙色</td><td>Sarstedt</td><td>65.793.516</td><td>每包 1,000 个</td></tr><tr><td>红色</td><td>Sarstedt</td><td>65.793.518</td><td>每包 1,000 个</td></tr><tr><td>黑色</td><td>Sarstedt</td><td>65.793.519</td><td>每包 1,000 个</td></tr><tr><td>紫色</td><td>Sarstedt</td><td>65.793.520</td><td>每包 1,000 个</td></tr><tr><td>混合颜色</td><td>Sarstedt</td><td>65.793.999</td><td>每包 1,000 个</td></tr><tr><td>唾液皮质醇酶联免疫检测试剂盒</td><td>Salimetrics</td><td>1.3102</td><td>诊断试剂盒</td></tr><tr><td>唾液α-淀粉酶酶联免疫检测试剂盒</td><td>Salimetrics</td><td>1.1902</td><td></td></tr><tr><td>丁腈手套</td><td>VWR</td><td>（见下文）</td><td></td></tr><tr><td>特小号</td><td>VWR</td><td>82026-423</td><td>每盒 100 只</td></tr><tr><td>小号</td><td>VWR</td><td>82026-424</td><td>每盒 100 只</td></tr><tr><td>中号</td><td>VWR</td><td>82026-426</td><td>每盒 100 只</td></tr><tr><td>大号</td><td>VWR</td><td>82026-428</td><td>每盒 100 只</td></tr><tr><td>特大号</td><td>VWR</td><td>82026-43</td><td>每盒 100 只</td></tr><tr><td>隔热运输容器</td><td>ThermoFisher</td><td>根据尺寸不同而变化</td><td>&lt;a href=&quot;https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=14100-420">访问 VWR 选择尺寸并下单&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4 英寸样品储存盒（7 x 7）</td><td>Sarstedt</td><td>95.064.949</td><td>每盒可容纳 49 个 SST</td></tr></tbody></table>

通过家庭照护者采集体弱社区居住老年人的唾液并测量唾液皮质醇和α-淀粉酶

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

唾液检测指标在生物行为学研究中逐渐受到关注，因其易于采集、侵入性小且相对经济，是评估应激状态的生物学标志物。本文介绍了在体弱、社区居住的老年人群研究中采集与分析两种唾液检测指标——唾液皮质醇和唾液α-淀粉酶的操作步骤。唾液生物科学领域正在迅速发展，本综述旨在为有意将这些指标应用于衰老研究的研究人员提供最新进展。文中提出了指导家庭照护者在家庭环境中采集唾液样本的策略，以及开展唾液分析物实验室检测的方法，这些方法已被证明具有可行性、高依从性，并能获得高质量的样本。样本采集方案包括：（1）统一使用标准化采集材料；（2）采用标准化方法以提高依从性并最小化受试者负担；（3）控制某些混杂因素的操作流程。我们还提供了实验室分析的策略，包括：（1）唾液的处理与加工；（2）唾液皮质醇和唾液α-淀粉酶的检测流程；（3）分析过程中的注意事项。

本方案旨在提供一种在社区环境中采集唾液生物标志物的示例。该操作流程用于测定唾液α-淀粉酶和唾液皮质醇浓度的昼夜变化特征（图2）。
分析策略
皮质醇检测结果通常呈正偏态分布，因此建议对数据进行对数转换，以获得正态分布。目前有多种策略可用于分析皮质醇和α-淀粉酶昼夜节律的差异。第一种策略是绘制觉醒反应曲线（i.e. 比较清醒时与清醒后30分钟内α-淀粉酶或皮质醇的昼夜变化）15。第二种策略是绘制全天皮质醇或α-淀粉酶浓度的总量（曲线下面积，AUC）。所得的汇总参数可分为两大类：1）反应幅度的测量指标；2）随时间变化的反应模式的测量指标。对于在一天中对个体进行多次采样的研究，增长曲线模型可能具有应用价值16,17。通过在个体水平或测量水平引入预测变量，可拟合增长曲线以反映个体间昼夜节律的差异18。
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我们展示了以下内容：（1）由家庭护理人员在家庭环境中为认知功能受损的老年个体采集唾液样本的操作步骤；（2）通过唾液皮质醇和α-淀粉酶检测应激活动的操作步骤；（3）典型的检测结果图谱。这些使研究者能够探究与应激相关生理过程的实验方案，有助于加深我们对生物敏感性与易感性的理解。

唾液检测指标已在生物行为学研究中崭露头角，其采集简便、侵入性小且相对经济，是一类易于获取的生物学标志物……

本方案的总体目标是展示如何在居住于社区内的医学脆弱人群中进行唾液生物样本的采集与分析。首先需准备必要的唾液采集用品，其次安排上门访问，向照护者提供采集用品并演示唾液采集操作流程。接下来，提供书面说明并解答任何问题。最后一步是将唾液样本送回实验室并进行检测操作。该方案最终旨在测量居住在社区中的体弱多病患者唾液中α-淀粉酶和唾液皮质醇浓度的昼夜变化特征。该方法将解答生物行为学研究领域中的关键问题，以增进我们对压力相关过程中生物敏感性与易感性的理解。在安排上门访问之前，已签署知情同意书的参与者需收集并准备好必要的材料，包括四个儿童用心理测量棉签、四个棉签储存管、四个彩色编码管帽、五张白色标签、一个塑料自封袋、一份唾液采集说明表、五副一次性手套以及一个储存盒。使用戴有一次性手套的手，将四个Salome儿童用棉签分别放入四个棉签储存管中，并依次盖上黄色、橙色、蓝色和紫色的彩色管帽。接下来，在每个储存管上贴上标签，注明采集时间。将四个已盖盖的储存管、唾液采集说明表和四副硝基手套放入自封袋中，并用受试者编号和采集日期标记自封袋。按照计划，在唾液采样前一日，对先前已签署知情同意书的受试者进行一次简短的上门访视。到达受试者家中后，将装有 supplies 的塑料袋和说明书交给唾液采集人员。仔细查阅说明书，并重点强调需要记录唾液采集的开始和结束时间，可通过突出显示书面说明来提醒。记录参与者在过去 48 小时内使用的所有处方药和非处方药的名称、剂量及用药时间安排。指导唾液采集人员（SC）将硝化手套戴在惯用手上。告知受试者将头部前倾，使唾液积聚于口腔底部。随后，指导SC打开采样拭子储存管的盖子，取出口腔拭子。指导 SC 将口腔拭子置于老年人舌前下方，以吸收约三滴混合唾液，并保持拭子位置不动两分钟，确保充分浸润；然后让 SC 将浸润后的口腔拭子放回拭子储存管的篮架中，并盖上管盖。接着，让 SC 立即将试管放入储存盒中，并置于冰箱冷冻。丢弃手套至垃圾桶后，提醒 SC 在唾液采集说明表上记录开始和结束时间。接下来，告知SC（研究协调员）第二天需在四个时间点收集唾液样本，具体时间为：醒来时、醒来后30分钟、上午中段及晚上。让SC指导受试者在唾液采集前10分钟用水漱口。唾液采集后，应丢弃明显被血液污染的样本。指导SC将唾液样本保存在冷冻冰箱中，直至研究团队取回。联系研究团队，确认其将安排具体时间和日期取回冷冻样本，并为后续任何采集日期提供新的唾液采集用品。一旦样本从受试者的冰箱中取出，需将其放入保温冰袋中，确保在运输至实验室过程中保持冷冻状态。样本到达实验室后，将每根试管上的白色标签替换为连续编号的条形码。检查顺序条形码是否与受试者的样本采集日期和采集时间一致。然后将唾液样本放回-20摄氏度冰箱中，以沉淀黏蛋白。待唾液样本解冻后，以1500×g离心15分钟。当唾液检测试剂盒的试剂在室温下放置约90分钟后，按照试剂盒说明书配制洗涤缓冲液，将25微升的标准品、对照品和样品加入96孔板的相应孔中。随后，向各孔中加入200微升预先配制的酶结合物溶液。将板置于旋转器上，以500转/分钟（RPM）的速度旋转5分钟，以混匀样品。将样品在室温下孵育55分钟后，用洗涤缓冲液洗涤并吸干平板4次。然后加入200 µL四乙基联苯胺（TMB）溶液。待样品混匀5分钟后。在500 RPM条件下，用铝箔覆盖酶标板，并在避光条件下继续孵育25分钟。孵育结束后，加入50微升终止液，并在500 RPM下混匀3分钟。加入终止液后10分钟内，擦干酶标板底部，使用酶标仪在450纳米波长下读取吸光度。接下来，使用平均光密度计算皮质醇浓度。从零标准对照孔和样品孔的平均光密度中减去非特异性结合孔的平均光密度。最后，使用具备逻辑斯蒂拟合功能的软件估算对照品和未知样品的浓度。所述实验步骤旨在测定唾液淀粉酶和唾液皮质醇浓度的昼夜变化特征。由于皮质醇检测结果通常呈正偏态分布，建议对数据进行对数转换，以获得正态分布。目前有多种方法可用于分析皮质醇和淀粉酶昼夜节律的差异。第一种策略是绘制从清醒时至清醒后30分钟内α-淀粉酶或皮质醇的昼夜变化。第二种策略是绘制一天内皮质醇或α-淀粉酶的总浓度变化。所得的汇总参数可分为两大类：一类是反映反应幅度的指标，另一类是反映随时间变化反应模式的指标。生长曲线模型可能适用于在一天中对个体进行多次采样的研究。可以通过在个体水平或测量水平添加预测因子，拟合生长曲线以考虑个体在昼夜节律上的差异。观看本视频后，您应充分了解如何采集唾液样本，以及如何指导照护者在家庭环境中为老年患者采集唾液样本；同时，您还应掌握如何对唾液分析物进行实验室分析，这些方法应具备可行性、高依从性，并能获得高质量的样本。

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