Name: 体外 共生分析评估病原体诱导中性粒细胞跨上皮迁移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 了解体外共生分析方法，用于评估病原体诱导的中性粒细胞跨上皮迁移机制。该技术结合人中性粒细胞与极化上皮细胞层，通过髓过氧化物酶测定定量分析迁移过程，为研究黏膜感染免疫反应提供可靠实验模型。

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本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）提供经费支持（项目编号：1 R01 AI095338-01A1）。

<ol><li>Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+structural+features+that+influence+neutrophil+emigration+into+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung.</a> Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+defense+systems+protect+against+bacterial+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gastroenterol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats.</a> Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial-induced+hepoxilin+A3+secretion+as+a+pro-inflammatory+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator.</a> FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).</li>
<li>Mumy, K. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophils+in+the+event+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradox+of+the+neutrophil%27s+role+in+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">The paradox of the neutrophil's role in tissue injury.</a> J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).</li>
<li>Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+destruction+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue destruction by neutrophils.</a> N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).</li>
<li>Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxin+translocation+across+intestinal+epithelial+cells+is+enhanced+by+neutrophil+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration.</a> Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).</li>
<li>Kohler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+regulates+intercellular+junction+proteins+and+facilitates+transepithelial+neutrophil+and+bacterial+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).</li>
<li>Gane, J., Stockley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transmigration+across+the+vascular+endothelium+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD.</a> Thorax. 67, 553-561 (2012).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol. Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophilic+inflammation+in+severe+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol.%22%5BJournal%5D)">Neutrophilic inflammation in severe asthma.</a> Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).</li>
<li>Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transendothelial migration.</a> Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).</li>
<li>Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+to+investigate+neutrophil+adhesion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).</li>
<li>Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+to+the+lungs+during+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia.</a> Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+tissue+culture+results+into+animal+models%3A+the+case+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium.</a> Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+cell+transmigration+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+requires+the+eicosanoid+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+attachment+to+human+intestinal+epithelial+monolayers%3A+transcellular+signalling+to+subepithelial+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils.</a> J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).</li>
<li>McCormick, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+attachment+of+Salmonella+typhimurium+to+intestinal+epithelia+imprints+the+subepithelial+matrix+with+gradients+chemotactic+for+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils.</a> J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).</li>
<li>Mrsny, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hepoxilin+A3+in+inflammatory+events%3A+a+required+role+in+neutrophil+migration+across+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).</li>
<li>Tamang, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepoxilin+A%283%29+facilitates+neutrophilic+breach+of+lipoxygenase-expressing+airway+epithelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers.</a> J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).</li>
<li>McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+secretion+of+a+pathogen-elicited+epithelial+chemoattractant+activity+in+response+to+surface+colonization+of+intestinal+epithelia+by+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium.</a> J. Immunol. 160, 455-466 (1998).</li>
<li>Boll, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroaggregative+Escherichia+coli+promotes+transepithelial+migration+of+neutrophils+through+a+conserved+12-lipoxygenase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway.</a> Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).</li>
<li>Hurley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-component+sensor+response+regulator+RoxS%2FRoxR+plays+a+role+in+Pseudomonas+aeruginosa+interactions+with+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells.</a> Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).</li>
<li>Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-mediated+PMN+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).</li>
<li>McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+Shigella+flexneri+virulence+plasmid+in+the+ability+to+induce+trafficking+of+neutrophils+across+polarized+monolayers+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium.</a> Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).</li>
<li>Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+a+noninvasive+enteric+pathogen%2C+enteropathogenic+Escherichia+coli%2C+to+cultured+human+intestinal+epithelial+monolayers+induces+transmigration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils.</a> Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).</li>
<li>Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERM+protein%2C+ezrin%2C+regulates+neutrophil+transmigration+by+modulating+the+apical+localization+of+MRP2+in+response+to+the+SipA+effector+protein+during+Salmonella+typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).</li>
<li>Pazos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance-associated+transporter+2+regulates+mucosal+inflammation+by+facilitating+the+synthesis+of+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Bhowmick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Disease+during+Streptococcus+pneumoniae+Acute+Lung+Infection+Requires+12-Lipoxygenase-Dependent+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation.</a> J. Immunol. , (2013).</li>
<li>Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+eicosanoid-generating+capacity+of+cytoplasmic+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).</li>
<li>Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+involved+in+hepoxilin+A3-mediated+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration.</a> Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Topic+on+Pseudomonas+aeruginosa%2C+Biology%2C+Genetics%2C+and+Host-Pathogen+Interactions.%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.</a> Front. Microbiol. 3, 20 (2012).</li>
<li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+infections+associated+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lung infections associated with cystic fibrosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).</li>
<li>Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa-mediated+damage+requires+distinct+receptors+at+the+apical+and+basolateral+surfaces+of+the+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium.</a> Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).</li>
<li>Kierbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exploits+a+PIP3-dependent+pathway+to+transform+apical+into+basolateral+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).</li>
<li>Lee, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Salmonella+protein+induces+a+proinflammatory+response+in+epithelial+cells%2C+which+promotes+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).</li>
<li>Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+type+III+secretion+system+effectors+OspB+and+OspF+target+the+nucleus+to+downregulate+the+host+inflammatory+response+via+interactions+with+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein.</a> Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).</li>
<li>Brazil, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+across+intestinal+epithelium%3A+evidence+for+a+role+of+CD44+in+regulating+detachment+of+migrating+cells+from+the+luminal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface.</a> J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).</li>
<li>Lawrence, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiadhesive+role+of+apical+decay-accelerating+factor+%28CD55%29+in+human+neutrophil+transmigration+across+mucosal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia.</a> J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).</li>
<li>Hodges, K., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+communication+in+the+gut%2C+from+bacterial+delivery+to+host-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response.</a> J. Physiol. 590, 433-440 (2012).</li>
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

中性粒细胞迁移穿过黏膜上皮表面是细菌病原体感染后疾病病理中的常见特征3本文所述方法提供了一种快速、简便的实验方案，用于分离源自人细胞的这一特定事件 体外 模拟细菌感染引发的炎症过程特征的共培养实验系统。该系统最初是利用感染了肠道病原体的极化肠上皮细胞建立的，包括 鼠伤寒沙门氏菌, 志贺氏菌 福氏志贺氏菌以及多种致病性 大肠杆菌8,19,24,27,28每种致病性生物均可驱动中性粒细胞穿过生长于倒置的胶原包被可渗透Transwell滤膜上的极化肠上皮单层。该实验体系经改良后已适用于研究肺上皮屏障及病原体诱导的中性粒细胞跨上皮迁移。18,26除H292外，多项研究还采用了其他几种气道上皮细胞系，包括常被引用的A549、BEAS-2B和Calu-3肺上皮细胞系22,26. P. aeruginosa 引发肺部炎症，造成显著损伤，是急性肺炎和囊性纤维化等疾病的特征35,36如所述，该肺部病原体 P. aeruginosa 在感染肺...

黏膜表面作为物理和免疫屏障，能够抵御环境中普遍存在的外部威胁1,2。&#160;当病原体入侵时，这种保护性上皮屏障可能遭到破坏2。&#160;对于细菌性病原体而言，这种相互作用通常会通过激活先天免疫系统，引发一类被称为中性粒细胞的首批应答粒细胞的快速募集，从而启动炎症反应2-4。趋化因子部分由黏膜上皮细胞产生，以促进中性粒细胞的招募，帮助宿主清除致病菌2-4。&#160;中性粒细胞在黏膜上皮表面过度或持续性的浸润可导致显著的病理损伤1,5。&#160;这是由于中性粒细胞抗菌武器库对组织造成的非特异性损伤所致5-7。&#160;在此类情况下，中性粒细胞在清除细菌的同时，对宿主组织的破坏作用超过了其防御功能。&#160;保护性上皮屏障功能的破坏可使下层组织更易暴露于微生物和/或毒素，进一步加重疾病病理过程8,9。&#160;这些后果可在多个器官系统中观察到，包括肺和消化道1,5。&#160;此外，某些非感染性炎症性疾病，如重度哮喘发作、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和炎症性肠病（IBD），其特征也是由过度的中性粒细胞反应导致黏膜上皮屏障的病理性破坏4,5,10-12。
中性粒细胞在黏膜感染后募集的复杂过程涉及多个区室化的步骤1,5,13,14。&#160;首先，中性粒细胞必须通过一系列细胞间相互作用从循环中离开，从而实现跨内皮迁移1,13。&#160;接着，中性粒细胞需穿越含有细胞外基质的现有间质空间1,14。&#160;为了到达受感染黏膜的腔面，中性粒细胞必须进一步迁移穿过上皮屏障1,4,5。&#160;这一复杂的多步骤现象通常通过感染的in vivo动物模型进行整体研究15。&#160;这些模型有助于确定特定因子（如趋化因子、黏附分子或信号通路）在整个过程中的必要性，但在解析各个独立区室化步骤中关键的分子贡献方面往往不够充分16。&#160;在这方面，模拟中性粒细胞跨内皮、跨基质或跨上皮迁移的共培养in vitro系统已被证明特别有用1,14,16,17。&#160;
一种稳健的共培养检测系统已被开发出来，用于解析病原体感染诱导中性粒细胞跨上皮迁移的机制18-22.&#160;该模型包括用细菌病原体感染极化的人上皮细胞层的顶面，随后将 freshly isolated human neutrophils 应用于基底面18-22.&#160;中性粒细胞在病原体感染后，响应上皮细胞分泌的趋化因子，迁移穿过上皮屏障18,21-23.&#160;该模型系统已应用于肠道和肺上皮细胞培养，通过暴露于相应组织特异性的细菌病原体，揭示了在黏膜感染过程中中性粒细胞募集可能涉及的新型分子机制3,8,19,24-28.&#160;该方法的优势在于 体外 共培养模型的优势在于，这种简化的方法可使研究者在高度可控、可重复性高且相对经济的体系中，对病原体、上皮屏障和/或中性粒细胞进行实验性操控。&#160;通过这一方法获得的见解可有效用于中性粒细胞募集过程中区室化事件的针对性分析 体内 感染模型22,29,30.
本文演示了成功建立该可重复模型所需的多个步骤，以研究病原体诱导的中性粒细胞跨上皮迁移。&#160;本文以病原体 Pseudomonas aeruginosa感染的肺上皮屏障为例；然而，通过少量修改，也可替换为其他组织上皮和病原体。&#160;文中详细介绍了在倒置的胶原包被的可通透Transwell滤膜上接种和培养极化肺上皮细胞层的方法，以及致病性P. aeruginosa的培养和从中性粒细胞全血中分离中性粒细胞的步骤。&#160;本文还展示了如何将这些组分结合，以观察病原体诱导的中性粒细胞跨上皮迁移，并提供了适当的阳性和阴性对照，以建立可重复的检测体系。&#160;本文结合文献中的具体研究，讨论了该方法在探究病原体诱导中性粒细胞跨上皮迁移不同方面的广泛适用性。

<table><tbody><tr><td>NCl-H292 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; PAO1</td><td>ATCC</td><td>#47085</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; MC1000</td><td>ATCC</td><td>#39531</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) 液体</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td>不含钙和镁</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>添加至培养基中，终浓度为 10%</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100 倍浓缩液：每毫升含 10,000 单位青霉素和 10,000 &amp;micro;g 链霉素</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.05%)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>分装为 50 ml，于 -20 &amp;ordm;C 冻存。&amp;nbsp; 使用中的分装可短期存放于 4 &amp;ordm;C。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液 - HBSS(-)</td><td>Invitrogen</td><td>14175-079</td><td>无菌，不含钙和镁</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061.</td><td>储存液 = 0.4%</td></tr><tr><td>大鼠尾胶原蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>也可使用标准方案直接从大鼠尾部分离获得</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>1 M 柠檬酸盐缓冲液和酸性柠檬酸葡萄糖 (ACD) 溶液的组分</td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td>1 M 柠檬酸盐缓冲液的组分</td></tr><tr><td>无水葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8066-250G</td><td>酸性柠檬酸葡萄糖 (ACD) 溶液的组分</td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213330-500G</td><td>红细胞 (RBC) 裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td>红细胞 (RBC) 裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td>红细胞 (RBC) 裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>HBSS(+) 粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387-10L</td><td>HBSS+ 的关键组分</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>HBSS+ 的组分</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td>按照供应商说明对玻璃移液管尖端进行包被</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 二铵盐 (ABTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9941-50TAB</td><td>ABTS 底物溶液的关键组分</td></tr><tr><td>30% 过氧化氢溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>ABTS 底物溶液的组分</td></tr><tr><td>N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸 (fMLP 或 fMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-3506</td><td>应配制 10 mM 的储存液于 DMSO 中，并分装后于 -20 &amp;ordm;C 保存</td></tr><tr><td>明胶 B 型</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-12026</td><td></td></tr><tr><td>铜绿假单胞菌分离琼脂&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0927-17-1</td><td>按照制造商&amp;rsquo;s 说明制备 PIA 平板</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-749</td><td>可选，可提高中性粒细胞纯度</td></tr><tr><td>24 孔迁移板</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3524</td><td></td></tr><tr><td>24 孔洗涤板</td><td>Falcon</td><td>35-1147</td><td>若在重复使用前用 70% 乙醇浸泡并彻底清洗，可重复使用</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12565501</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 可渗透支持膜&amp;nbsp;</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3415</td><td>聚碳酸酯；直径：6.5 mm；生长面积：0.33 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;；培养皿类型：24 孔板；孔径：3.0 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Falcon</td><td>35-1013</td><td>每个培养皿可容纳 24 个倒置的 0.33 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Transwell。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml 0.2 &amp;mu;m 滤器/烧瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25A</td><td>用于酸性柠檬酸葡萄糖 (ACD) 溶液的除菌</td></tr><tr><td>5-3/4 英寸玻璃巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>使用前需用 Sigmacote 包被尖端</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td>弯曲，带齿</td></tr><tr><td>Invertoskop 倒置显微镜</td><td>Zeiss</td><td>#342222</td><td></td></tr><tr><td>Versa-Max 微孔板读数仪</td><td>Molecular Devices</td><td>#432789</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 共培养实验评估病原体诱导的中性粒细胞跨上皮迁移

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

黏膜表面作为抵御病原生物的保护屏障。&#160;先天免疫反应在感知病原体后被激活，导致以中性粒细胞为主的炎性细胞迁移并浸润组织。&#160;如果过度进行或处于未解决状态，该过程可能对组织具有破坏性。&#160; 共培养 体外 模型可用于研究病原体诱导中性粒细胞跨上皮迁移过程中涉及的独特分子机制。&#160;此类模型在实验设计上具有灵活性，可对病原体、上皮屏障或中性粒细胞进行可控性操控。&#160;在可渗透的Transwell小室滤膜上培养的极化上皮单层，其顶面受到病原体感染时，会引发从基底侧向顶侧跨上皮迁移的生理相关性中性粒细胞迁移，中性粒细胞被施加于基底侧表面。&#160;的 体外 本文所述模型展示了证明中性粒细胞迁移穿过受病原体感染的极化肺上皮单层所需的多个步骤 P. aeruginosa (PAO1)&#160;描述了利用人源性肺上皮细胞在可渗透的Transwell小室中进行接种和培养的方法，以及从全人血中分离中性粒细胞和培养铜绿假单胞菌PAO1与非致病性K12菌株的过程 E. coli (MC1000)&#160; 迁移过程及对因病原体感染而被激活并成功迁移的中性粒细胞进行定量分析的代表性数据，包括阳性与阴性对照。&#160;这 体外 该模型系统可被操控并应用于其他黏膜表面。&#160;涉及过度中性粒细胞浸润的炎症反应可能对宿主组织造成破坏，并可在无病原体感染的情况下发生。&#160;通过实验操控促进中性粒细胞跨上皮迁移的分子机制的更深入理解 体外 本文所述的共培养检测系统在识别多种黏膜感染性和炎症性疾病的新治疗靶点方面具有重要意义。

多项研究表明，病原体感染的上皮层可促进中性粒细胞跨上皮迁移3,8,19,24-28,31,32。这一过程通过病原体特异性诱导上皮细胞产生中性粒细胞趋化梯度而实现3,23。例如，致病性 P. aeruginosa 与肺上皮细胞顶面相互作用后，可引起大量中性粒细胞迁移穿过上皮层18,22,25,26,33,34。该具有临床相关性的检测系统可与适当的对照结合，通过多种方式进行调控，以揭示关键的病原体和宿主分子作用因子。
将中性粒细胞加入未预先感染的极化上皮细胞层时，中性粒细胞无法以可观的数量迁移穿过上皮层。然而，在未感染的上皮层两侧施加趋化因子梯度，则可驱动大量中性粒细胞穿越。在研究中性粒细胞迁移穿过病原体感染的上皮层时，每项实验均需分别设置这两种阴性与阳性对照。阴性对照用于确定在无信号刺激条件下穿过上皮层的中性粒细胞本底数量。当培养的上皮细胞已形成功能性屏障时，该数值应极低。若本底迁移率过高，将影响对病原体感染上皮组织所得结果的解读。阳性对照是指在上皮层两侧施加中性粒细胞趋化因子（如fMLP）的浓度梯度...

中性粒细胞在黏膜细菌感染刺激下发生跨上皮迁移，可导致上皮损伤及临床疾病。&#160;一个 体外 已开发出一种模型，该模型结合了病原体、人中性粒细胞以及在Transwell滤膜上培养的极化人上皮细胞层，以促进对调控此现象的分子机制进行深入研究。

黏膜表面作为抵御病原生物的保护屏障。当感知到病原体后，先天免疫反应被激活，进而导致……

以下实验的总体目标是确定在感染刺激下穿过上皮细胞单层的中性粒细胞数量。该目标通过在transwell小室中包被胶原蛋白，随后利用倒置transwell滤膜法精心培养上皮细胞单层来实现。第二步是培养细菌病原体，用于感染transwell滤膜上生长的上皮细胞单层的顶膜表面，从而诱导上皮细胞产生内源性中性粒细胞趋化因子。随后，将从全血中分离的中性粒细胞加入生长于Transwell滤膜上的感染肠上皮单层细胞的基底外侧，以检测中性粒细胞从基底外侧向顶侧的迁移情况。通过定量迁移中性粒细胞中髓过氧化物酶的含量，结果显示，在感染的肠上皮单层细胞刺激下，跨上皮迁移的中性粒细胞数量显著增加。该方法的可视化演示至关重要，因为采用倒置Transwell滤膜技术培养并感染上皮屏障的方法较为非常规，对于不熟悉该技术的研究团队而言，在实验室中建立该体系可能存在一定难度。该技术的应用前景可拓展至涉及感染的气道炎症性疾病（如肺炎或囊性纤维化）的治疗，因为可以开发并测试新型治疗方法，以减少中性粒细胞跨上皮迁移的数量，从而减轻中性粒细胞过度反应所导致的黏膜屏障破坏等有害影响。与我实验室的临床研究员 Mark 一同演示该实验操作的还有高级技术员 Wahi Preza 和博士后研究员 Michael Pesos。实验开始时，从包装中取出具有 0.33 平方厘米生长面积、孔径为 3 微米的 Transwell 小室，并将装有 12 个 Transwell 小室的 24 孔板倒置于生物安全柜中。取下底部平板并放置一旁。此时Transwell将呈倒置状态。将止血钳置于24孔板盖子上方进行火焰灭菌，并静置冷却。使用无菌止血钳将Transwell小室转移至一个150 × 25毫米的培养皿中，保持其倒置状态。用移液器将70微升预先配制的30微克/毫升胶原溶液（溶于乙醇）滴加到每个倒置Transwell的滤膜表面。由于滤膜周围无侧壁，表面张力应足以使该体积的溶液稳定附着于滤膜上。注意避免胶原溶液沿Transwell侧壁流下，并在包被过程中避免移动Transwell。打开培养皿盖，静置至少4小时，以使乙醇完全挥发，同时保持操作过程的无菌状态。按照文本方案所述，在包装上皮细胞后，保持通风橱风扇和紫外灯开启。从15毫升离心管中取70微升Resus重悬的细胞悬液，加入每个倒置的胶原蛋白包被的Transwell小室中。在接种Transwell小室的过程中，通过定期轻柔地倒置15毫升离心管来混匀细胞悬液，以防止细胞沉降到管底。在所有倒置的Transwell小室接种上皮细胞后，盖上培养皿盖，并于次日小心地将细胞放入组织培养孵育箱中。向原始无菌24孔板的每个孔中加入1毫升培养基，并使用无菌止血钳将每个倒置的Transwell小室翻转入含有1毫升培养基的孔中。向每个Transwell小室的上室中加入0.2毫升培养基，然后放回组织培养孵育箱中。从培养箱中取出已在Transwell滤膜下表面培养至少八天的支持上皮层的24孔板。用止血钳夹住每个Transwell的边缘，将其从24孔板中取出。将Transwell倒置在废液桶上方，以弃去Transwell内腔中的培养基。将每个Transwell浸入含有钙和镁的Hank's平衡盐溶液或Hank's Plus的洗涤烧杯中，以填充Transwell的内室。然后将内室中的液体弃入废液桶中。重复此步骤一次。经过两次洗涤后，用Hank's Plus溶液洗涤。将Transwell小室放入一个新的24孔板中，每孔加入一毫升Hank's Plus溶液。在每个孔中观察每个Transwell的上层腔室，以评估上皮细胞层的完整性。将含有1毫升Hank's Plus的Transwell放入24孔板的孔中时，Hank's Plus不应渗漏并充满Transwell的上室。仔细观察每个Transwell后，向其上室加入0.2毫升Hank's Plus。将培养板置于培养箱中孵育30至60分钟，使上皮细胞层达到平衡，以进行中性粒细胞跨上皮迁移实验。用止血钳夹住已置于Hank's Plus中平衡的24孔板中的每个transwell，将上室中的液体弃入废液桶中。将每个transwell倒置放入150 mm × 25 mm的培养皿中，共放置六个倒置的transwell。向其中三个倒置的transwell中各加入25 µL的Hanks plus。用 25 微升铜绿假单胞菌（Pseudomonas arosa）或 Pao1，按文本方案所述用 Hank's Plus 稀释至终浓度，感染细胞；在倒置的 transwell 中，用 25 微升大肠杆菌（E. coli）K-12 或 MC1000，同样按文本方案所述用 Hank's Plus 稀释后感染细胞。在 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中孵育 60 分钟后，用止血钳夹住 transwell，翻转使其回到含有 1 毫升 Hank's Plus 的 24 孔洗涤板中进行洗涤。洗涤液置于底部腔室中。向顶部小室中加入 0.2 毫升 Hank's 加液。用止血钳夹住 Transwell，从第一个洗涤板中取出。将顶部小室中的液体弃入废液桶中。在将Transwell插入另一个含有1毫升Hanks plus的24孔洗涤板之前，先向每个Transwell的上室中加入0.2毫升Hanks plus。重复此步骤一次，共进行三次洗涤。第三次洗涤后，使用止血钳将Transwell上室中的液体弃至废液桶中。取三个未感染的Transwell放入24孔迁移板的三个孔中，每孔含1毫升Hanks Plus，作为阴性对照；向另外三个含1毫升Hanks plus的24孔迁移板孔中各加入10微升10微摩尔的FMLP溶液，并将三个未感染的Transwell放入这三孔中，每孔含100纳摩尔FMLP，作为分离中性粒细胞迁移能力的阳性对照。然后将感染了 PAO1 的三个 trans 小室和感染了 mc1000 的三个 trans 小室分别放入含有 1 毫升 Hank's 液的 24 孔迁移板中的三个对应孔中，并在每个 trans 小室的上室中加入 0.1 毫升 Hank's 液，覆盖 trans 小室中已有的 0.1 毫升 Hank's 液。小心地向每个 trans 小室的上室中加入 20 微升按文本方案所述制备的中性粒细胞悬液。孵育 2 小时，以允许中性粒细胞跨上皮迁移。迁移两小时后，用止血钳夹住Transwell小室并轻轻敲击24孔迁移板的内壁。在弃去Transwell小室之前，将24孔迁移板置于倒置显微镜下，使用10倍物镜观察各孔，宏观评估中性粒细胞的迁移情况。随后向24孔迁移板中每个已使用的孔、每个标准孔以及空白孔中加入50微升10% Triton X-100。将24孔迁移板的标准品和空白样品在4摄氏度下低速旋转20分钟。加入50 µL柠檬酸盐缓冲液。在24孔迁移板中，每个标准品孔和空白对照孔各取两孔。通过反复吹打溶液至少五次，混匀各样品孔中的内容物。然后将每个样品孔中的100微升溶液重复加样两次，转移至96孔板；同时将每个标准品和空白对照的100微升溶液转移至96孔板。混合后，向A BTS溶液中加入50 µL的30%过氧化氢并涡旋振荡。然后向每个样品中加入100 µL A BTS底物溶液。在96孔板上，于避光条件下反应5至10分钟。在使用405纳米波长读数前，观察含有裂解中性粒细胞的孔中绿色的生成情况。使用微孔板读数仪评估中性粒细胞跨上皮迁移时，已完全迁移穿过上皮层到达顶腔的中性粒细胞可在24孔迁移板的底层孔中观察到，如本图中使用倒置光学显微镜所示。在未受感染的上皮层中，若无外加趋化梯度，观察到迁移的中性粒细胞极少，代表本实验中的背景水平。相比之下，当提供FMLP梯度时，可见大量迁移的中性粒细胞。当上皮层感染非致病性大肠杆菌MC1000时，仅观察到少量迁移的中性粒细胞；而当上皮层感染肺部致病性铜绿假单胞菌（Pseudomonas aerogen）时，则可观察到大量迁移的中性粒细胞。实验中已迁移的中性粒细胞通过测定其髓过氧化物酶活性进行定量。中性粒细胞的数量与裂解中性粒细胞后测得的过氧化物酶活性呈正相关，所测数值在标准曲线选定的中性粒细胞数量范围内表现出线性关系。在FMLP梯度刺激下，或在PAO1感染的上皮层刺激下，有大量中性粒细胞迁移穿过上皮层。在无刺激物存在时，或在非致病性大肠杆菌MC1000从顶端感染上皮层后，迁移的中性粒细胞数量低于该检测方法的检测限。掌握该技术后，可在5小时内完成胶原蛋白包被以及在Transwell滤膜上接种上皮细胞的操作，随后至少需要一周时间以使上皮细胞生长。一旦上皮细胞单层形成，若操作得当，迁移实验可在5小时内完成，包括中性粒细胞的分离以及细菌的制备。在进行该操作时，重要的是要记住必须在无菌条件下准备Transwell滤膜，以防止污染。该操作可根据需要进行调整，以回答与此炎症过程相关的其他问题。可对迁移的细胞、上皮层、仰卧位，甚至病原体进行分析。

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体外共培养实验评估病原体诱导的中性粒细胞跨上皮迁移

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