体外 共生分析评估病原体诱导中性粒细胞跨上皮迁移

以下实验的总体目标是确定响应感染而穿过上皮细胞单层的中性粒细胞的数量。这是通过胶原蛋白编码 transwell 来实现的，然后使用倒置 transwell 过滤器作小心培养上皮细胞单层。作为第二步，培养细菌病原体以感染在 transwell 过滤器上生长的上皮单层的顶端表面，这会导致上皮细胞产生内源性中性粒细胞化疗引诱剂。

接下来，将从全血中分离的中性粒细胞添加到在 transwell 过滤器上生长的感染上皮单层的基底外侧，以检测中性粒细胞从基底外侧到顶端的迁移。获得的结果表明，基于迁移的中性粒细胞过氧化物酶的定量，响应感染的上皮单层观察到的反上皮迁移中性粒细胞的数量显着增加。这种方法的视觉演示至关重要，因为用于生长和感染上皮屏障的倒置 transwell 滤池作是非常规的，因此对于不熟悉的研究小组来说，在他们的实验室中建立可能不太容易接近。

该技术的意义延伸到涉及感染的气道炎症性疾病（如肺炎或囊性纤维化）的治疗，因为可以开发和测试新的治疗方法来减少中性粒细胞跨上皮迁移的数量，这可能会减轻过度热衷的中性粒细胞、粘膜屏障突破的有害影响。高级技术员 Wahi Preza 和博士后研究员 Michael Pesos 将与我实验室的临床研究员 Mark 一起演示该程序。首先从包装中取出 0.33 平方厘米的生长区域，孔径为 3 微米的 Transwells，并将包含 12 个 transwell 的 24 孔板倒置在引擎盖内。

取下底板并放在一边。Transwells 现在将倒置。放在 24 孔板火焰的盖子上，一个用于无菌的止血剂并冷却。

使用无菌止血钳转移 transwell 到 150 x 25 毫米的培养皿中，将它们保持在倒置位置，将 70 微升制备的每毫升 30 微克胶原蛋白溶液移液到每个倒置的 transwell 表面的滤膜上张力应将此体积的溶液保持在适当的位置，因为当进入底部表面时，滤膜周围没有壁。注意胶原蛋白溶液不要从 transwell 的侧面滴落，并避免在涂层过程中移动 transwell。将培养皿的盖子关闭至少四个小时，让乙醇蒸发，以在此过程中保持无菌。

按照文本协议中的说明包装上皮细胞后，保持罩风扇和紫外线灯亮起。将 70 微升 Resus 悬浮细胞溶液从 15 毫升试管中加入到每个倒置的胶原蛋白涂层 transwell 中。通过定期轻轻倒置试管来混合细胞悬液，以防止细胞在接种 transwell 时沉降到 15 毫升试管的底部。

一旦所有倒置的 transwell 都接种了上皮细胞，第二天更换培养皿盖并小心地将细胞放入组织培养箱中。将 1 毫升培养基添加到原始无菌 24 孔板的每个孔中，并使用消毒的止血钳将每个倒置的反式孔翻转到含有 1 毫升培养基的每个孔中。将 0.2 mLs 培养基加入每个反式孔的顶部腔室中，然后放回组织培养箱中。

从培养箱中取出已在 Transwell 滤膜底部培养至少 8 天的 24 孔板支撑上皮层。用止血钳抓住每个反式孔的边缘，然后将其从 24 孔板中取出。将 transwell 倒置在废液桶上，以丢弃 Transwell 内腔中的培养基。

将每个 transwell 浸入含有 Hank 平衡盐溶液、钙和镁或 Hank's Plus 的洗涤烧杯中，以填充 Transwell 的内腔。然后将内腔中的液体倒入废液桶中。重复此步骤一秒钟。

两次洗涤后在 Hank's plus 中洗涤。将 Transwell 放入含有 1 毫升 Hank's Plus 的新 24 孔板中。在每个孔中观察每个 transwell 的顶部腔室以评估上皮细胞层的完整性。

当 Hank's Plus 放入含有 1 毫升 Hank's Plus 的 24 孔板的孔中时，Hank's Plus 不应泄漏并填充 Transwell 的顶部腔室。仔细观察每个 transwell 后，将 0.2 毫升 Hanks Plus 添加到顶部腔室中。将板置于培养箱中 30 至 60 分钟，以平衡上皮细胞层，以进行中性粒细胞跨上皮迁移测定。

用在 Hank's Plus 中平衡的 Wash Transwells 的 24 孔板中的止血钳抓住每个 transwell，并将顶部孔中的液体丢弃到废液桶中。将每个 transwell 倒置在 150 x 25 毫米的培养皿中，放入六个倒置的 transwell 中。将 25 微升 Hanks plus 添加到三个倒置的 transwell 中。

用 25 微升假单胞菌、arosa 或 Pao 1 感染细胞，在 Hanks plus 中稀释，如文本方案中所述制备，最后三个倒置 transwell 用 25 微升大肠杆菌、K 12 或 mc 1000 稀释在 Hanks Plus 中稀释，也按照文本方案制备，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下在加湿室中孵育 60 分钟后。用止血钳抓住 transwells 并将其翻转回含有 1 毫升 Hank's plus 的 24 孔洗涤板中，以清洗 transwells。在底部腔室。

将 0.2 毫升 Hank's plus 添加到顶部腔室中。用止血钳抓住 Transwell，然后将其从第一个洗涤板中取出。将顶部腔室中的液体丢弃到废液桶中。

在将 Transwell 放入第二个 24 孔洗涤板之前，该洗涤板含有 1 毫升 Hanks 加 0.2 毫升 Hanks plus，添加到顶部腔室。再重复此步骤一次，总共洗涤 3 次。第三次洗涤后，使用止血钳将液体从反式孔的顶部腔室丢弃到废液桶中，将三个未感染的反式孔放入含有 1 毫升 Hanks Plus 的 24 孔迁移板的三个孔中，这代表阴性对照移液管将 10 微升 10 微摩尔的 FMLP 溶液放入含有 1 毫升 Hanks 的 24 孔迁移板的三个孔中的每一个加上将三个未感染的反式孔放入含有 100 纳摩尔 FMLP 的 24 孔迁移板的三个孔中，这代表了分离的中性粒细胞迁移能力的阳性对照。

然后将感染 PAO one 的三个反式孔和感染 mc 1000 的三个反式孔放入含有 1 毫升 Hanks 的 24 孔迁移板的三个相应孔中，并在每个反式孔的顶部腔室中加入 0.1 毫升 Hanks plus。小心地加入 20 微升按照文本方案中所述制备的中性粒细胞悬液。孵育 2 小时，使中性粒细胞进行跨上皮迁移。

迁移两小时后，用止血钳抓住 transwells，然后轻轻敲击 24 孔迁移板的内壁。在丢弃反式孔之前，通过使用 10 x 物镜在倒置显微镜下观察 24 孔迁移板的孔，粗略评估孔中嗜中性粒细胞的迁移。然后向 24 孔迁移板中使用的每个孔、每个标准品和空白中加入 50 微升 10% Triton X 100。

低速旋转 24 孔迁移板标准品和空白 20 分钟。在 4 摄氏度。加入 50 μL 柠檬酸盐缓冲液。

在 24 孔中各使用两个孔，将迁移板彻底迁移至每个标准品和空白。通过上下吹打溶液至少五次，将每个样品中的内容物充分混合。然后将每个样品孔的 100 微升一式两份转移到 96 孔板转移中，将每个标准品转移 100 微升，并将空白转移到 96 孔板中。

混合后，向 A BTS 溶液中加入 50 微升 30% 过氧化氢并涡旋。然后向每个样品中加入 100 微升 A BTS 底物溶液。在 96 孔板上，让板在黑暗中显影 5 到 10 分钟。

在以 405 纳米的波长读取之前，观察含有裂解嗜中性粒细胞的板孔中绿色的形成。使用酶标仪评估中性粒细胞反式上皮迁移中性粒细胞已完全穿过上皮层迁移到顶端腔的嗜中性粒细胞可以在 24 孔迁移板的底部孔中查看，如此处使用倒置光学显微镜进行可视化。观察到极少数中性粒细胞在没有施加趋化梯度的情况下迁移穿过未感染的上皮层，并且代表测定中的背景水平。

相比之下，当提供 FMLP 梯度时，丰富的跨中性粒细胞是明显的。非致病性大肠杆菌 mc 1000 感染上皮导致很少可见的反式迁移中性粒细胞，而当上皮层感染肺致病性气原假单胞菌时，可以观察到许多反式迁移的中性粒细胞。通过测量其骨髓过氧化物酶活性来定量实验中迁移的中性粒细胞。

中性粒细胞的数量与中性粒细胞裂解后测量的过氧化物酶活性量呈正相关，其值在为标准曲线选择的中性粒细胞数量范围内呈线性关系。大量中性粒细胞响应 A 提供的 FMLP 梯度或响应于 PAO 1 感染的上皮层而跨上皮层迁移。在没有刺激的情况下或在非致病性大肠埃希菌 mc 1000 感染顶端上皮后迁移的中性粒细胞数量低于测定的检测限。

一旦掌握，这项技术可以在 5 小时内完成，用于胶原蛋白涂层并将上皮细胞接种到 transwell 过滤器上，然后至少一周让上皮细胞生长。一旦上皮单层准备好了。迁移测定可以在 5 小时内完成，包括中性粒细胞的分离和细菌的制备（如果作得当）。

在尝试此过程时，请务必记住在无菌条件下准备 transwell 过滤器以防止污染。该程序可以进行调整，以回答与此炎症过程相关的其他问题。可以对迁移的细胞、上皮细胞、仰卧细胞甚至病原体进行分析。