生产用锌指核酸载脂蛋白C-III淘汰赛兔

该程序的总体目标是开发用于研究人类心血管疾病的新型兔子模型。这是通过首先设计和合成靶向目标基因的锌指核酸酶来实现的。该程序的第二步是将 ZFN RNA 显微注射到原核期胚胎的细胞质中。

第三步是通过手术将胚胎移植给受体兔子。最后一步是对新生儿进行基因分型以识别转基因动物。通过 ZFN 进行总体基因靶向非常有效，这里通过创建 A OC 三基因敲除兔子来证明这一点。

这项技术是基因工程的里程碑，它是第一个能够生产无代码兔子的技术。这项技术的影响延伸到许多人类疾病的治疗，例如心血管疾病。人们越来越意识到，需要大型动物模型来更好地模拟人类的生理和病理。

当我们在 2009 年阅读报道使用红色显著核酸酶成功进行基因靶向的文章时，我们第一次有了这种方法的想法。一般来说，知道这种方法的人会很挣扎，因为它涉及细胞血浆显微注射构建体。虽然这种方法可以提供对基因靶向兔子的见解，但它也可以应用于其他系统，例如猪。

从超级排卵、性成熟的新西兰白兔开始，每天两次皮下注射 FSH，为期三天，每天增加剂量。最后一次 FSH 注射后 72 小时，静脉注射 200 IU HCG 以单独诱导排卵，此后立即使超级排卵雌性。此时，还必须准备一只接收动物。

授精后 16 至 18 小时，用戊巴比妥钠对超级排卵的供体兔实施安乐死。通过仔细收集整个子宫来恢复 UCT 浆。UCS 和卵巢结构通过从 UCT 的子宫端注射培养基，用 10 毫升作培养基冲洗每个 UCT。

将 UCT 卵巢端的冲洗培养基收集在培养皿中。回收的胚胎位于冲洗的培养基中。接下来，用作培养基洗涤胚胎 3 次。

然后将胚胎在 38.5 摄氏度的正常空气中在作培养基中孵育。在 19 到 21 小时。授精后，使用立体显微镜选择胚胎。

对于每种注射条件，收集大约 30 个处于原核阶段的胚胎，预计每个超级排卵女性有 30 到 40 个这样的胚胎。提前。从制造商处获得目标基因的 ZFN 集。

选择具有最佳 ZFN 分数的那些。在这个例子中，感兴趣的基因是 A OC 3。为了制备 ZFN mRNA，首先转录 ZFN 信使、体外 RNA 和多腺苷酸转录本。

接下来，纯化得到的 mRNA 和 resus。将其悬浮在 RNA spree 0.1 xte E 中，然后使用分光光度计测量 RNA 浓度，并在 10 微升小瓶中以 4 至 10 ng/μL 的浓度制备编码 ZFN 对的 mRNA 的等分试样以供储存。首先将显微注射阶段加热到 38 摄氏度。

要准备显微注射平台，首先，从单孔室载玻片中取出介质室，然后以 5 微升的作液滴。中等大小的载玻片，并用矿物油覆盖。将准备好的载玻片放在加热的显微镜载物台上。

接下来，将直径为 120 微米的固定移液器固定到微米纵器上，并将移液器放入平台上的培养基液滴中。现在解冻要在冰上注射的 mRNA。将它们装入注射移液管中，该移液管使用微量移液器拉拔器由硼硅酸盐玻璃毛细管锻造而成。

接下来打开连接到微型喷射器的压缩空气供应。接下来，将注射移液管固定到其支架上，并将其连接到第二个微米纵器。将此移液器也放入培养基液滴中。

现在将微量进样器配置为 1 至 5 pgo liter 的进样体积。打开注射移液管的尖端。轻轻敲击固定移液器。

使用玻璃移液器将 30 到 50 个胚胎转移到显微作中。降落在平台上。然后以 100 倍放大倍率。

使用固定移液器捕获胚胎。将固定移液管和胚胎对准现在低于 400 x 的注射针。将注射移液管推进胚胎。

小心避开细胞核。一旦质膜被刺穿，注射后踩下脚踏板注射 mRNA，拔出针头并释放胚胎。对所有剩余的胚胎重复该过程。

一旦它们全部注射，在胚胎培养物中洗涤胚胎 3 次。中速，每次洗涤 30 秒。然后将胚胎在 38.5 摄氏度和 5% 二氧化碳空气中孵育一到两个小时，然后将胚胎转移给同步接受者。

母兔。为了将胚胎培养到爆炸辅助阶段，培养箱必须有加湿空气。选择一只 5 到 12 个月大的雌性 NZW 兔，身体健康，体重 4 到 5 公斤。

首先给予促性腺激素，肌肉注射释放激素，准备她作为受体动物。注射激素后 16 至 24 小时，用氯胺酮和/或汽化的氟麻醉兔子。当兔子完全失去知觉时，它不会产生踏板反射。

手术前挤压脚垫时，用眼药膏保护眼睛并准备腹部。在手术过程中，记录兔子的生命体征。每 15 分钟一次，首先在皮肤上做一个约 2.5 厘米的切口，然后沿着肌肉层。

将每个卵巢连同连接的子宫角一起外侧，用拇指和食指夹住一个卵巢。通过小心插入的无菌移液管将胚胎转移到输卵管。通常每 10 个注射胚胎中有 25 到 30 个胚胎是可行的，并且它们都可以移植给一个受体。

通过用涂层可吸收缝合线闭合肌肉层来完成手术。用可吸收的皮下缝合线或简单的间断不可吸收皮肤缝合线缝合皮肤。然后让动物保持温暖并观察它直到它的严肃。

达到卧位。最初设计了 16 对 ZFN。第一组的目标破坏序列位于 OC 三组的外显子 2 处。

选择 1、2 和 3 并进行酵母处理。MEL 一个报告基因测定来确定 ZFN 活性集，一个的 ZFN 评分比第 2 组和第 3 组高 224.2%，远高于选择阈值，即内部阳性对照的 50%。因此，选择第一组进行体外验证实验，将第一组 mRNA 显微注射到 35 个兔胚胎中。

与未进行显微注射组的胚胎相比，显微注射组的 BL 率似乎较低，表明发育能力略有受损。显微注射组的 18 个胚胎在第 5 天发育到 BL 阶段，其中 16 个被测序。目标位点的 4 次突变频率远高于选择阈值，表明一组 1 对 ZFN 是有效的，总共 145 个胚胎。

将显微注射的第一组 ZFN mRNA 转移到 7 只假怀孕受体兔子中。未进行 ZFN 微量注射的新鲜冲洗胚胎在妊娠 30 天后转移至受体作为对照组。显微注射组诞生了 21 个试剂盒。

PCR 测序确定 5 例为阳性敲除。目标位点的插入缺失包括 2 次插入和 3 次缺失。生物信息学分析用于识别与第一序列不匹配 7 次或更少的潜在 ZFN 脱靶，仅鉴定出一个可能的脱靶位点，并且 PCR 在任何创始动物中均未检测到该位点的事件。

观看此视频。您应该对如何通过锌生产 knockout rabbits 有很好的了解。指核显微注射。

一旦掌握了胚胎收集，如果作得当，可以在四个小时内完成显微注射和转移。在尝试此程序时，请务必记住，注射材料是 RNA，这需要格外小心。按照此程序，将进行表型分析以了解目标基因的生物学规则。