在皮肤中的单神经末梢体内双光子显微镜

以下程序的目的是研究选择性病变后皮肤神经末梢的纵向动态变化。为此，我们麻醉 YFP 转基因小鼠并将其放在加热垫上以保持体温。将后爪放在塑料包装材料上，并在皮肤上滴一滴水，以达到更好的光学耦合效果。

用牢固地固定在金属杆上的玻璃盖玻片盖住后杆，以确保稳定性。放入一滴水浸水物镜，并在显微镜成像上执行两次。结合激光诱导的神经末梢病变，多种病理状况影响皮肤整合的动力学。

检查这种效果的最佳方法之一是直接在活体动物的皮肤内可视化皮肤神经末梢的病理变化。Vivo to Photo microscopy 是这种方法的绝佳工具。在成像之前，称量小鼠并通过注射浓度为 80 μg pergram 体重的氯胺酮 en 甲苯噻嗪来诱导麻醉。

在每克体重 10 微克的浓度下。通过轻轻捏住鼠标的后肢来验证麻醉。使用粘稠的眼药水来防止老鼠的眼睛脱水。

在成像以进行稳定时，我们使用专有设计的带环的金属固定器。将小滴胶水滴在戒指上并均匀涂抹。然后将盖玻片连接到金属环上。

为了促进均匀覆盖小鼠皮肤进行成像，我们使用市售的配备电动载物台的双光子显微镜。我们将盖玻片朝下的金属环固定在牢固地连接到显微镜载物台上的实心金属棒上。我们通过将动物的体温保持在 37 摄氏度，将其保持在 37 摄氏度。

用乙醇清洁后杆。在皮肤表面滴一滴水浸泡。将 Hein 杆放在玻璃盖玻片和塑料包装材料之间。

调整材料以实现后爪的最佳定位。在玻璃杯顶部滴一滴水以确保物镜浸没。在物镜下方用固定的后爪驱动载物台。

首先，使用 epi 荧光灯找到合适的数据采集区域。找到感兴趣的神经末梢并记下其坐标，以便在同一区域进行重复测量。一旦我们专注于适当的神经，我们就可以切换到双光子模式。

在光电倍增管上设置合适的电压。选择图像大小，通常介于 500 到 800 像素之间，并设置激发波长。例如，YFP 为 915 纳米。

获取图像堆栈后，继续进行病变程序。我们使用奥林巴斯软件包中提供的漂白程序，并将曝光时间设置在 100 毫秒到 1 秒之间。取决于每个特定皮肤区域的光学特性。

找到一个你想做病变的地方，然后打开漂白程序。病变后，使用延时成像在几分钟、几小时或几天内进行双重成像跟踪变化。通常，图像会话的持续时间约为 1 小时，但可以根据任务轻松调整。

测量后，我们用鼠标将载物台从物镜上驱动开来。将鼠标带到温度为 37 摄氏度的恢复盒中，直到它醒来。然后可以在几天甚至几个月内重复成像程序。

在离线分析过程中，有时需要对感兴趣的信号进行 UNIX，例如来自重叠阶荧光的 YFP 荧光。我们使用 Image J 软件进行光谱解混。打开图像堆栈并拆分通道。

找到神经末梢区域与头发或其他结构明显区分开来。你想从它 Unix 开始。使用名为 spectral and mixing 的插件来计算 unmixing 矩阵的参数。

首先，找到无信号区域以测量背景噪声水平。然后仔细勾勒出头发中可以与神经末梢区分开来的部分。您进行选择越精确，分离就越好。

然后精确勾勒出神经末梢的一个区域。最后，使用相同的插件并应用获得的矩阵来解混数据。头发神经现在应该出现在两个不同的通道中。

因此，我们可以重建神经纤维的三维结构并跟踪随时间的变化。您可以使用从几分钟到几天甚至几个月的不同时间尺度。此外，还可以使用其他转基因小鼠品系，例如，那些在线粒体中表达荧光标记的小鼠品系。

在体内，表面结构的多照片显微镜检查与适当的转基因模型相结合是研究生理和病理生理过程和皮肤的有力工具。我们在本视频协议中演示的方法论方法揭示了一些基本技巧，这些技巧允许以简单、可靠和非侵入性的方式在啮齿动物方案中对周围神经进行多倍显微成像和显微外科作。由于该方法可以很容易地应用于各种可用的转基因荧光模型，我们希望该视频能帮助其他进行表面成像实验的研究人员。

感谢您的观看，祝您的实验好运。