成像变性的胶原股在体内和体外通过光引发杂交笼胶原蛋白仿生肽

以下实验的总体目标是证明胶原蛋白重塑活性的体内成像，以及通过胶原蛋白模拟肽杂交实现胶原蛋白和组织组织切片的离体可视化。这是通过在紫外线照射后将笼状胶原蛋白模拟肽折叠成三螺旋以实现体内胶原蛋白重塑 用近红外荧光力标记的笼状胶原蛋白模拟肽在静脉注射前立即被紫外线照射激活，它切割笼组并触发 CMP 通过形成三螺旋与胶原蛋白链杂交用于离体组织染色， 羧基荧光素标记的笼状胶原模拟肽在固定的组织切片上直接进行光激活，导致胶原模拟肽与组织切片中存在的变性胶原链杂交。近红外荧光成像和荧光显微镜分析的结果显示，CMP 靶向体内重塑组织以及固定组织切片中的变性胶原链，以制备用于 IV 注射的光活化 CMP。

首先在灯预热时打开 UV 灯。将新鲜制备的近红外染料、标记的笼状 CMP 肽溶液缓慢吸出到带有透明桶和 28 至 30 号针头的 0.5 毫升胰岛素注射器中。然后，在小心去除任何气泡后，将注射器直接放在紫外线灯下 5 分钟，以光激活肽。

同时，将鼠标放在加热灯下的限制器中。用永久性记号笔标记尾巴，然后在光活化后立即用 70% 乙醇对尾巴进行消毒。将 100 微升肽溶液注入尾部后端的尾静脉中。

注射后将鼠标放回笼中，以对体内胶原蛋白重塑活性进行成像。首先，使用 pearl Impulse 2.0 软件将脉冲成像仪成像床的加热板设置为 37 摄氏度。然后打开珍珠成像仪抽屉，将一只麻醉的裸鼠放在成像床上。

鼠标就位后，关闭抽屉。然后，当仪器在图像软件面板上指示就绪时，单击 700 通道白光和 85 微米框，然后单击"获取图像"按钮。录制完成后，打开抽屉，转动鼠标，然后从另一个角度获取图像以获取高分辨率图像。

注射后 24 至 96 小时。使用手术钳和剪刀去除小鼠的皮肤，然后通过近红外荧光对动物进行成像，就像刚才展示的获得的近红外荧光一样。然后可以分析图像以可视化胶原蛋白和组织切片。

将前缀室温平衡的小鼠角膜载玻片放入加湿室中。然后在室温下将每张玻片放入 0.5 mL 封闭溶液中孵育。半小时后，将玻片贴在纸巾上以去除封闭溶液，然后用大约 100 μL 羧基荧光素标记的笼式 CMP 溶液覆盖每个组织切片两分钟。

当 CMP 溶液渗透到组织中时，加热紫外灯，然后将 CMP 覆盖的组织切片暴露在紫外光下 6 分钟，以去除笼中 CMP 的保护。紫外线照射后，用一块参数覆盖每张载玻片，以防止组织切片变干，并将载玻片存放在 4 摄氏度的加湿室中两个小时。CMP 染色后，使用一对镊子轻轻去除参数。

将载玻片堵在纸巾上以去除多余的 CMP 溶液，然后将每个组织切片在大约 100 μL 新鲜稀释的 dappy 溶液中在室温下孵育 1 分钟。接下来，将玻片浸入染色罐中的 PBS 中 3 次，每次洗涤使用新鲜 PBS 5 分钟。然后向每个组织切片中加入一滴封固剂，并将玻璃盖玻片放在每张载玻片上。

注意避免气泡滞留，将载玻片放在纸板载玻片托盘中避光。最后，在荧光显微镜下对胶原蛋白链进行成像。在第一组图像中，光触发 IR 染料 6 80 分布的典型结果，标记的笼中 CMP 和健康的雌性 SKH 1 裸鼠。

显示注射后 24 至 96 小时。请注意注射后 24 小时骨骼中明显的 CMP 积累，之后大多数未结合的肽在注射后 96 小时已基本清除。去皮小鼠的近红外荧光图像清楚地显示了骨骼对 IR D 6 80 的摄取，标记的 CMP 在脊柱肋骨以及膝盖、脚踝、手腕和下颌骨内。

在离体组织染色中，光触发荧光标记的笼状 CMP，特异性杂交组织切片中变性的胶原链。在这些最终图像中，CMP 染色清楚地揭示了角膜基质的细小平行胶原纤维，验证了 CMP 作为胶原特异性染色剂的使用。基于 CMP 胶原蛋白杂交的经过验证的成像方法为研究人员提供了一种研究组织重塑过程的新工具，并可能导致为与高胶原蛋白重塑活性相关的疾病（如癌症、骨质疏松症、关节炎和纤维化）开发新的诊断方法。