鼠心肌细胞的分离及生理分析

该方案的目标是使用 LOR 灌注从具有已知遗传学的成年小鼠心脏中分离心肌细胞，并分析肌细胞的收缩力和钙瞬变。注射肝素后，从麻醉的小鼠中取出心脏。它通过主动脉快速安装到连接到灌注缓冲液注射器的套管上。

主动脉是安全的。缓慢灌注缝合线和缓冲液以清除冠状动脉。然后将套管安装到带有流动灌注缓冲液的 LOR 装置上。

心脏用胶原酶和蛋白酶的无钙溶液消化，直到它明显柔软。将左心室置于无钙缓冲液中，并用镊子和轻柔移液分散。溶液通过网片过滤后，细胞逐渐引入更高的钙浓度，以去除死细胞并确保肌细胞耐钙。

健康细胞是棒状的，而死细胞则缺乏这种形式。然后用 RA 2 A 放射性钙结合染料加载肌细胞，并放置在显微镜的载物台上。为了进行分析，细胞是电起搏的，同时使用肌节长度和边缘检测测量收缩力，并通过分析 RA 两个加载细胞的光谱偏移来测量钙瞬变。

扩张型心肌病是由多种突变引起的。然而，了解这种心脏病背后的机制可能很困难。分离心肌细胞使我们能够分析心脏收缩细胞的收缩力和钙瞬变，无钙和 1.2 毫摩尔。

Calcium tyro 溶液可以在分离当天提前制备。根据书面方案准备无钙 profusion 缓冲液酶消化、缓冲液和转移缓冲液 A 和 B。使用前通过 0.2 微米过滤器过滤所有溶液。

根据书面方案混合缓冲液 A 和 B，使转印缓冲液 1 到 4 增加钙浓度。将 LOR 装置的流速设置为每分钟 3 毫升，并设置循环水浴温度，使套管尖端的流出量约为 37 度。将 70% 乙醇通过系统运行 15 分钟，然后加入 100 毫升水，确保去除系统中的所有气泡。

在第一次分离之前，通过将一小段 PE 50 管连接到 20 3G 诱饵短接头的尖端来制作套管，然后加热管的尖端以形成一个小唇。将套管连接到装满灌注缓冲液的小 lu lock 注射器上。确保套管充满缓冲液。

通过 IP 注射向小鼠注射 200 个肝素。开始通过 L endorf 运行大量缓冲液，使其在连接心脏之前完全流经系统。五分钟后，用 isof fluorine 麻醉小鼠。

确保鼠标完全麻醉以牢固地捏住双侧脚趾。通过切开胸骨下方和胸腔的两侧来打开胸部，快速切除心脏，小心让尽可能多的主动脉附着在心脏上。立即将心脏放入冰中。

冷丰缓冲液，尽快起效 在解剖显微镜下，去除任何多余的组织。小心去除多余的脂肪，而不会损坏下面的主动脉。将主动脉修剪到第一分支的正下方。

使用两对细镊子，小心地抓住主动脉的边缘，轻轻拉过套管的尖端。确保套管尖端没有穿过主动脉瓣进入左心室。用 5.0 缝合的小环固定主动脉。

轻轻地将少量灌注缓冲液推入套管，观察冠状动脉是否清除血液。从注射器中取出套管，并连接到具有流动灌注的 L endorf 装置上。缓冲区。小心不要引入任何气泡。

让灌注缓冲液流经心脏 2 到 3 分钟。灌注 8 应从血性到清澈的开关流过渡到消化、缓冲和消化 7 到 10 分钟。缓冲液填充后，一旦可触及心脏，就可以回收 lang endorf 流。

Flacid，从套管中取出，放入含有缓冲液的 P 60 培养皿中 a. 去除心房、大血管和右心室，转移到第二个缓冲液培养皿中 a. 使用镊子。

轻轻地将左心室分成小块。如果心脏被充分消化，组织应易于分离，用无菌 5 mil 移液管轻轻移液数次，以进一步分散细胞。使用无菌移液管将含有细胞和组织的溶液通过 250 微米尼龙网过滤器转移到 50 毫升锥形管中。

让细胞沉淀约 10 分钟。活细胞会沉降到沉淀的底部，死细胞会漂浮。将沉淀转移到 0.06 毫摩尔钙转移缓冲液中。

静置 10 分钟，吸出含有死细胞的上清液，然后将沉淀转移到 0.24 毫摩尔的钙溶液中。通过增加钙溶液重复沉淀吸液和转移，直到细胞在 1.2 毫摩尔钙转移缓冲液中沉淀。此时，沉淀将包含许多健康的杆状细胞，不会自发收缩以加载染料较少或两种染料的细胞。

将 1 mil 重悬的细胞转移到 1 mil 的 eend 孤儿管中。在无水 DMSO 中加入 1 微升 1 毫摩尔 fira 2。轻轻倒置试管混合。

细胞沉淀洗涤后，吸出上清液并加入 1.2 毫摩尔酪氨酸钙溶液，让细胞在黑暗中沉淀 15 至 20 分钟。混合并让细胞再静置 5 到 10 分钟。然后重复洗涤。

设置倒置显微镜以进行数据收集。首先，将玻璃盖玻片放在专为大量吸液和细胞电起搏而设计的载物台插件上。如果使用油性物镜，请在 40 x 镜头上滴一滴油，然后将载物台插件放在显微镜上。

连接电极。设置重力驱动的 1.2 毫摩尔钙酪氨酸溶液的加热富集，并将吸液连接到真空中。打开显微镜和细胞起搏器系统。

打开 ion 向导软件。将几滴或两滴加载的细胞加载到载物台上，同时阻止灌注流。为了让健康细胞沉淀，恢复丰富，许多剩余的死细胞将被洗掉。

使用目镜定位一个健康的杆状细胞，该细胞在以 5 到 20 伏特自发起搏时收缩，应避免因膜渗漏而收缩细胞。更改摄像机的视觉输出。调整镜头的旋转，使单元格在窗口中可见。

调整光圈，以便去除大部分背景。将肌节测量标记物放在具有均匀肌节的细胞区域上。如果需要，如有必要，更改框的大小，以确保标记不会覆盖不同的群体。

同时对齐边缘检测条。在开始实验前 10 到 15 秒开始对细胞进行起搏。开始录制。

使用 ion 向导软件分析肌节缩短和 URA 两个比率迹线。野生型心肌细胞和敲除型心肌细胞之间的可能比较包括用于收缩性分析的达到峰值的分数缩短时间缩短至 50% 松弛，以及基线达到峰值的时间和达到 50% 基线恐惧的时间或两个比率，以评估钙通量。使用该方案产生的细胞是许多其他实验和程序的理想选择，包括亚细胞成分的染色和短期培养。

现在您已经观看了此视频，您应该能够从野生型和敲除小鼠中分离心肌细胞，并分析这些细胞的收缩力和钙瞬变。祝你的实验好运。